Isl1增强子冗余性调控小鼠后肢发育的遗传学证据

本研究通过CRISPR/Cas9技术构建Isl1 HLPE基因敲除小鼠模型，发现该增强子缺失虽不导致显著形态缺陷，但会引起长骨缩短和软骨形成基因表达紊乱。研究证实HLPE作为Isl1表达的重要调控元件（与SALL4协同作用有限），揭示了后肢发育中存在的增强子冗余调控机制。

　　

^亮点

^{Isl1 HLPE-/-新生鼠未表现显著形态缺陷}

为探究Isl1 HLPE对后肢发育的必要性，我们通过CRISPR/Cas9技术对C57BL/6受精卵中的Isl1 HLPE序列进行删除。F0代小鼠与野生型C57BL/6杂交后，在F1代确认了缺失等位基因的种系传递。通过基因组DNA PCR和桑格测序，我们证实了CR1和CR2的双重缺失（图S1）。经Isl1 HLPE^+/- F1代小鼠交配，我们获得了野生型、Isl1 HLPE^+/-和Isl1 HLPE^-/-的出生当日（P0）新生鼠（品系1）。Isl1 HLPE^-/-新生鼠存活至成年期且具有生育能力，其体型、体重和后肢形态与野生型同胞无明显差异（图1A-B）。此外，我们通过Alcian blue/alizarin red染色对骨骼制备进行观察，未发现明显的骨骼模式异常（图1C）。这些结果表明，Isl1 HLPE的缺失不会引起严重的发育缺陷。

^{通过Isl1 HLPE调控后肢祖细胞中Isl1表达}

Isl1作为关键调控因子，参与多种细胞类型的发育过程，包括后肢祖细胞（Kawakami et al., 2011）、运动神经元（Pfaff et al., 1996; Song et al., 2009）以及窦房结起搏细胞（Liang et al., 2015）等。目前已在侧板中胚层后肢祖细胞（Jurberg et al., 2013; Tahara et al., 2018）、运动神经元（Kim et al., 2015）和起搏细胞（Galang et al., 2020）中鉴定出Isl1表达的特定增强子。值得注意的是，不同增强子可能通过协同或冗余机制调控Isl1的空间特异性表达。本研究重点关注Isl1 HLPE（包含CR1和CR2序列）在后肢祖细胞中的功能。

^{作者贡献声明}

Yasuhiko Kawakami： 研究构思、方法论设计、资源整合、经费获取、形式化分析、验证、项目管理、监督、论文撰写（初稿）。Hiroko Kawakami： 形式化分析、论文审阅与编辑。Seth Olson： 形式化分析、研究实施、论文撰写（初稿）。Corinne Boerner： 形式化分析、研究实施、论文审阅与编辑。Alexandra Maria Nichitean： 形式化分析、研究实施、论文审阅与编辑。Dylan Corcoran： 研究实施。Cailin McMahon： 研究实施。Ryuichi Nishinakamura： 资源支持。Maureen Cetera： 资源支持。Amel Awad： 研究实施。

^经费声明

本研究获得美国国立卫生研究院（NIH）授予YK的基金支持（项目编号R01AR064195）。资助机构未参与研究设计、数据收集与分析、发表决策及论文制备过程。

^{利益冲突声明}

作者声明不存在任何利益冲突。

^致谢

我们衷心感谢Lauren Brackney、Sofiia Fursa、Nhi Huynh、Yeon-Ji Kim、Jackson Moorman、Mira Schrandt、Will Sullivan和Matthew Walters提供的卓越技术支持。同时感谢Nobuaki Kikyo博士分享实验材料，Sho Kawakami博士协助统计分析，以及明尼苏达大学小鼠遗传学实验室的Yun You博士团队在Isl1 HLPE突变鼠培育中的专业服务。

^结论

（根据用户要求，本部分内容终止于第二个Conclusion前）