工业酵母中细胞周期调控与PPP通路协同作用增强木糖发酵和乙酸耐受性的表观遗传机制研究

本研究针对木质纤维素生物炼制中酵母菌株木糖利用效率低和抑制剂耐受性差的关键问题，通过两阶段进化策略获得了性能提升的工业酵母菌株AceY.14。研究人员通过全基因组测序发现ZWF1E191D和CLN3T556fs突变功能验证显示，这些突变通过降低木糖醇积累、增强PPP非氧化分支通量和改变细胞周期进程，显著提高了木糖发酵效率和乙酸耐受性。研究还发现isu1Δ/zwf1Δ双突变体存在协同效应，双倍体衍生株AceY-2n在不同原料水解液中表现出优异性能。该研究为理性设计工业酵母平台提供了新靶点和重要见解，对可持续生物燃料和生物制品生产具有重要意义。

　　

随着全球能源需求增长和化石燃料消耗对环境的不利影响，开发可持续技术已成为当务之急。木质纤维素生物质作为第二代(2G)生物技术原料，能够生产各种生物产品，是极具前景的可持续替代方案。然而，要实现木质纤维素生物炼制的工业化潜力，仍面临重大瓶颈：酵母菌株需要高效利用复杂的生物质衍生糖类，同时耐受预处理过程中产生的抑制剂。

在木质纤维素水解液中，乙酸是一个主要挑战。在发酵过程的低pH条件下，乙酸以未解离形式存在，能够扩散穿过细胞膜，导致胞质酸化。细胞通过膜ATP酶活性(Pma1p)输出质子来抵抗pH下降，但这会消耗ATP，直接影响细胞生长和生产率。除了影响细胞内pH和能量水平外，乙酸还会抑制核酸合成和修复、酶活性、大分子生物合成，并破坏细胞膜完整性，影响质子梯度。

为了解决这些挑战，研究人员对一株工业酵母菌株进行了两阶段进化。该菌株已通过木糖异构酶(xylA)途径进行了工程化改造。第一阶段进化获得了LVY34.4菌株，该菌株通过ISU1基因的功能缺失突变和xylA基因的串联扩增，获得了快速木糖同化和发酵能力。第二阶段进化针对乙酸耐受性，在木糖作为唯一碳源、半厌氧条件下进行，乙酸浓度从4 g/L逐步提高到8 g/L。

通过这种强烈的选择压力，研究人员获得了进化菌株AceY.14，该菌株表现出改善的发酵性能和增强的乙酸耐受性。全基因组测序发现，进化菌株中xylA基因拷贝数显著减少，可能减轻了与高木糖异构酶表达相关的代谢负担。同时发现了ZWF1和CLN3基因的突变，这两个基因分别编码戊糖磷酸途径(PPP)的组成部分和G1周期蛋白。

研究人员通过CRISPR和逆向工程对这两个突变进行了功能验证。zwf1^E191D突变减少了木糖醇积累，减轻了对木糖异构酶的抑制，并增强了通过PPP非氧化分支的通量。而cln3^T556fs移码突变意外地改善了进化菌株中的乙酸耐受性和木糖消耗，同时也影响了细胞大小和生长。

研究还发现，isu1Δ/zwf1Δ双突变体存在协同效应，进一步提高了木糖消耗速率。研究人员通过自交获得了双倍体衍生株AceY-2n，该菌株在使用不同木质纤维素原料的水解液发酵中表现出高生产率和鲁棒性，突显了该菌株在工业规模应用中的潜力。

这些发现揭示了菌株优化的新代谢靶点，为可持续生物燃料和生物产品生产的酵母平台理性工程提供了宝贵见解。该研究发表于《Bioresource Technology》，为木质纤维素生物炼制提供了重要的理论基础和技术支撑。

研究采用的主要技术方法包括：两阶段适应性实验室进化(ALE)策略，使用Illumina平台进行全基因组测序和SPAdes工具包进行基因组组装，CRISPR/Cas9 EasyGuide系统进行基因编辑和突变验证，高效液相色谱(HPLC)分析代谢产物，蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络分析，以及使用来自四种不同生物质原料(甘蔗秸秆、甘蔗渣、能源甘蔗渣和桉树)的水解液进行发酵性能评估。

2.1. 乙酸加速了两阶段进化过程用于C5发酵和耐受性

研究人员在木糖作为唯一碳源的条件下，通过逐步增加乙酸浓度(从4 g/L到8 g/L)进行进化。在8 g/L乙酸浓度下获得的进化细胞群体AceY显示出比亲本菌株LVY34.4更好的糖消耗和更高的乙醇生产率。从AceY群体中分离出的50个最大菌落中，一些克隆的最大体积木糖消耗速率比亲本菌株高出三倍。在无抑制剂条件下，所有分离株也表现出比LVY34.4更快的木糖同化速率，表明适应性进化不仅增强了抑制剂耐受性，还提高了进化菌株的木糖消耗速率。其中AceY.14菌株在乙酸存在下表现出最高的木糖消耗，证实了其抑制剂耐受性。

2.2. 全基因组测序揭示了xylA拷贝数的精细调整和稀疏SNP出现

AceY.14的全基因组测序显示，先前在LVY34.4中扩增的包含xylA和LEU2基因的6,237 bp区域没有进一步扩增，反而减少了约20个拷贝，导致该菌株中近CEN5处整合了约16个xylA拷贝。这种拷贝数减少可能有助于减轻与这种异源蛋白高水平表达相关的代谢负担。除了拷贝数变异外，研究人员还发现了ZWF1基因中的氨基酸替换(谷氨酸变为天冬氨酸，E191D)和CLN3基因中的移码突变(T556fs)。蛋白-蛋白相互作用网络分析没有揭示这些突变基因或相关代谢途径之间的直接联系，突显了酵母代谢网络在响应进化压力时的适应性可塑性。

2.3. 研究ZWF1突变对表达xylA菌株中木糖利用的作用

ZWF1编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，催化PPP氧化相的第一步。缺失ZWF1的突变体表现出比C5TY对照菌株更好的木糖发酵性能。携带点突变zwf1^E191D的菌株也表现出改善的性能，尽管程度不如敲除菌株。特别是，zwf1Δ和zwf1^E191D菌株的最大生产率速率分别比C5TY对照提高了约97%和66%。缺乏ZWF1的菌株还显示出最低的木糖醇产量。点突变可能降低了Zwf1p的活性而不是消除其功能，因为缺失和点突变在测试条件下表现出不同的表型。

2.4. ZWF1功能缺失与ISU1代谢在提高木糖消耗速率中具有协同效应

研究人员发现isu1Δ/zwf1Δ双突变体表现出增强的木糖消耗特征，体积生产率比isu1Δ提高了22%。这种发酵性能优于两个单突变体zwf1Δ和isu1Δ，表明两种突变之间存在协同相互作用，对木糖消耗产生积极影响。这种观察到的上位性相互作用可能反映了由于ISU1缺失而改善的XI活性以及降低的木糖醇产量，再加上通过非氧化PPP的通量扩展，这是由ZWF1缺失引起的氧化相失活所驱动的代谢重组。

2.5. G1周期蛋白CLN3对细胞周期进程、木糖发酵和乙酸抗性的影响

CLN3编码一种G1周期蛋白，负责启动细胞周期。CLN3缺失导致细胞周期进程延迟和细胞大小增加。CLN3突变体(敲除和点突变)表现出与亲本菌株相似的生长模式，但它们的木糖消耗和乙醇生产率高于对照。cln3^T556fs突变体导致功能丧失，因为它导致在CLN3缺失突变体中观察到的大细胞表型，并显示出在cln3Δ突变体中也存在的木糖消耗速率增加。CLN3突变体在琼脂平板和液体培养基中显示出比对照略高的乙酸耐受性，表明CLN3中的T556fs变体主要负责在乙酸胁迫下在AceY.14菌株中观察到的增强生长。

2.6. 木质纤维素水解液发酵生产可持续生物燃料

研究人员通过自交AceY.14获得了双倍体菌株AceY-2n，用于发酵来自四种不同生物质类型的水解液：甘蔗秸秆、甘蔗渣、能源甘蔗渣和桉树。在所有水解液中，木糖消耗只有在葡萄糖几乎耗尽后才开始，这是由葡萄糖诱导的分解代谢物抑制所预期的。在所有使用四种不同生物质类型的发酵中观察到高乙醇产量，从甘蔗渣水解液中获得了1.856 g/L h^-1的最高乙醇体积生产率。这些结果突出了该菌株有效耐受抑制剂和发酵来自四种不同生物质来源的糖的能力，强调了其在工业环境中大规模生物燃料生产的潜力。

本研究展示了进化策略在提高酿酒酵母对木质纤维素生物炼制鲁棒性方面的强大能力。进化菌株AceY.14显示出增强的木糖消耗和乙酸耐受性。全基因组分析确定了CLN3和ZWF1中的关键突变，并通过逆向工程得到确认。cnl3^T556fs突变增加了细胞大小和酸耐受性，而zwf1^E191D提高了消耗速率。在isu1Δ/zwf1Δ双突变体中观察到协同效应，证明了一种表观遗传相互作用。双倍体AceY-2n菌株高效发酵水解液且产量高。这些发现突出了CLN3和ZWF1作为工程化 robust 酵母用于第二代生物产品的重要靶点。

该研究的重要意义在于揭示了细胞周期调控与中央碳代谢之间的新型联系，为工业酵母的理性设计提供了新的遗传靶点。通过阐明ZWF1和CLN3基因在木糖发酵和乙酸耐受性中的重要作用，研究为开发更高效的微生物平台奠定了基础，有望满足工业规模生物 refinery 的需求。特别是发现的协同效应表明，通过多靶点工程可以进一步提高菌株性能，这为未来菌株优化提供了重要方向。

此外，该研究采用的两阶段进化策略结合系统生物学分析的方法，为复杂表型的工程化提供了成功范例。通过将适应性进化与精确的基因功能验证相结合，研究人员不仅获得了性能改善的工业菌株，还揭示了隐藏在表型改善背后的分子机制，这种研究思路对于未来微生物细胞工厂的开发具有重要的借鉴意义。