综述：CRISPR-Cas作为“分子捕捉器”追踪循环肿瘤细胞和细胞外囊泡的综述

本综述系统探讨了CRISPR-Cas系统在液体活检领域革命性应用。文章详述了如何将Cas9（基因编辑工具）、Cas12a（DNA检测）和Cas13a（RNA检测）与适配体识别、纳米材料富集及杂交链式反应（HCR）、滚环扩增（RCA）等信号放大技术融合，实现对循环肿瘤细胞（CTCs）和细胞外囊泡（EVs）的超灵敏检测，突破传统方法（如qPCR/ELISA）在灵敏度与临床适用性方面的局限，推动精准肿瘤学发展。

　　

Cas9：功能探索与靶点清除的基因组编辑器

Cas9是一种由HNH和RuvC催化结构域组成的核酸酶，能在单链向导RNA（sgRNA）引导下识别并切割含有5'-NGG-3' PAM（原间隔序列邻近基序）的双链DNA，从而破坏磷酸二酯键。该系统还包含CRISPR RNA（crRNA）和反式激活crRNA（tracrRNA）。CRISPR-Cas9系统最初应用于细菌和古菌的基因编辑，其PAM序列要求、特异性和编辑效率在不同变体中有所差异。

分子低语者：CTCs和EVs作为液体活检中的信息提供者

CTCs和EVs是液体活检中信息最丰富、最易获取的生物标志物。两者均直接来源于肿瘤组织，携带临床相关的分子特征，并在早期检测、治疗监测和转移预测方面展现出潜力。然而，它们固有的稀缺性、异质性和易降解性对精确分子检测提出了重大挑战。将新一代CRISPR诊断技术与CTCs和EVs分析相结合，为克服这些障碍提供了新途径。

切割、检测、揭示：CRISPR/Cas系统在追踪CTCs中的应用

CTCs分析为预测癌症进展和转移提供了宝贵信息，其丰度与癌症患者的不良结局显著相关。然而，CTCs在血液中的极端稀缺性对传统检测方法构成了重大挑战。为解决这些灵敏度和特异性的问题，研究人员转向了多功能CRISPR/Cas工具包，应用不同的Cas效应器实现不同的分析目的。

剖析无形：靶向EVs的CRISPR工具

CRISPR/Cas技术为精确、多功能地研究EVs提供了强大工具。本节涵盖三种关键方法：基于Cas9的基因组扰动用于研究EVs生物发生、模块化Cas12a平台用于多重EVs生物标志物检测，以及Cas13a系统用于EVs中的高分辨率RNA分析。这些策略共同凸显了CRISPR/Cas系统在推进EVs研究中的扩展作用。在此，我们探讨CRISPR/Cas驱动的EVs分析不断发展的前景。

Cas9、Cas12a和Cas13a在EVs和CTCs中的比较分析

选择特定Cas效应器进行液体活检很大程度上取决于目标生物分子和整体分析策略。

对于RNA或RNA生物标志物的直接检测，Cas13a已成为理想选择。作为一种RNA引导的RNase，Cas13a操作不依赖PAM序列，在识别目标后激活其反式切割活性以切割报告探针。这为靶向miRNA和mRNA等RNA提供了无与伦比的灵活性和特异性。

对于DNA靶点，Cas12a是首选工具，因为它具有强大的反式切割活性，简化crRNA设计，并与模块化传感器工程高度兼容。其广泛采用归功于其高效信号放大能力和快速检测时间。

相比之下，Cas9主要用于功能基因 interrogation，而不是直接诊断。其主要作用是通过基因编辑或调控来验证或消耗特定靶点，例如破坏CTCs中的致癌基因或研究EVs生物发生中的基因功能。

CRISPR系统在诊断应用中的局限性

尽管CRISPR系统具有卓越的特异性和可编程性，但其一些固有局限性限制了其诊断效用。脱靶效应——由引导RNA与非目标序列之间的部分错配（尤其是在种子区域外）引起——可能导致意外的切割事件和错误信号。这种风险在稀有细胞应用（如CTC或EV检测）中尤其成问题，因为信号保真度至关重要。高保真Cas变体和计算引导RNA设计工具已开发出来以减轻这些问题，但它们在复杂临床样本中的有效性仍需进一步验证。

另一个关键限制是PAM要求，它限制了可靶向的序列范围。例如，Cas9通常需要NGG PAM，而Cas12a识别TTTV PAM。虽然工程化变体扩大了PAM兼容性，但PAM约束仍然可能阻碍某些目标的检测。

临床变异性，包括样本预处理、EVs分离方法和分析前因素，可能显著影响CRISPR检测的性能。标准化协议和严格验证对于确保不同患者群体和临床环境中的结果可靠性和可重复性至关重要。

最后，将基于EVs的CRISPR诊断转化为临床实践面临独特挑战，例如EVs异质性、分离纯化困难以及区分肿瘤来源EVs与非肿瘤来源EVs。解决这些障碍需要多学科合作和技术创新。

结论

CTCs和EVs作为血液中的关键哨兵，在整个癌症 continuum（从早期检测、治疗监测到复发和转移评估）中提供肿瘤生物学的无创动态快照。随着这些稀有生物标志物继续塑造液体活检的格局，CRISPR/Cas系统重新定义了分子诊断的前景，提供了一个可编程、超灵敏和高度多功能的工具包，以克服CTCs和EVs分析中长期存在的挑战。