探索外显子切除作为ADGRV1相关视网膜色素变性的未来治疗策略：从蛋白质结构预测到功能验证

本研究针对ADGRV1相关视网膜色素变性(RP)缺乏有效治疗方法的现状，通过AlphaFold2蛋白质结构预测技术结合CRISPR-Cas9基因编辑，创新性地提出外显子切除治疗策略。研究发现切除ADGRV1外显子40-42可形成功能性杂交Calxβ结构域，在斑马鱼模型中证实能维持USH2蛋白复合体组装、视紫红质运输和正常视网膜电图(ERG)反应，并在HEK293T细胞中验证了该策略在人类基因组中的可行性，为精准治疗提供了新思路。

　　

在遗传性视网膜疾病研究领域，ADGRV1基因相关视网膜色素变性(RP)一直缺乏有效的治疗手段。这种由ADGRV1基因突变引起的Usher综合征2C型(USH2C)疾病，全球约4万人受影响，患者不仅先天听力受损，还会在青少年时期出现夜盲症状，随后视野逐渐缩小，最终在五六十岁时可能完全失明。更令人棘手的是，ADGRV1基因编码的蛋白长度达6,306个氨基酸，是目前已知最大的人类细胞表面蛋白，其巨大的尺寸超出了当前病毒载体的包装能力，使得传统的基因增强疗法难以实施。

面对这一挑战，研究人员将目光转向了外显子特异性治疗策略。类似针对杜氏肌营养不良症(DMD)和USH2A相关视网膜病变的外显子跳跃疗法，科学家们开始探索通过精确切除特定外显子来恢复蛋白质功能的可能性。然而，这种策略的成功关键在于选择合适的外显子靶点——需要确保切除后产生的缩短蛋白仍能保持正确的空间结构和生物学功能。

为了突破这一瓶颈，Radboud大学医学中心的研究团队开展了一项创新性研究。他们首先利用最新的AlphaFold2蛋白质结构预测技术，对ADGRV1蛋白的结构进行了重新审视。令人惊讶的是，三维模型显示ADGRV1具有比以往二维预测更为复杂的结构域架构：不仅包含了更多数量的Calxβ结构域（39个而非先前认为的35个），还发现了一个先前未识别的半胱氨酸富集结构域。更重要的是，研究团队观察到层粘连蛋白G样结构域、半胱氨酸富集结构域和癫痫相关重复序列(EAR)实际上是从Calxβ结构域中突出形成的，而不是作为独立结构域存在。

基于这些结构洞察，研究人员选择了两个不同的靶点进行验证：一个基于传统的SMART二维预测（外显子9），另一个基于新颖的三维结构分析（外显子40-42）。通过CRISPR-Cas9基因组编辑技术，他们在斑马鱼模型中成功构建了adgrv1^Δexon9和adgrv1^Δexon40-42两种突变体。

研究结果出现了鲜明对比：外显子9的切除完全阻断了Adgrv1蛋白的表达，而外显子40-42的切除却产生了能够正常表达和定位的缩短蛋白。进一步的功能分析表明，adgrv1^Δexon40-42斑马鱼不仅保持了Adgrv1^Δexon40-42蛋白在光感受器细胞连接纤膜区的正确定位，还维持了USH2蛋白复合体其他成员（usherin和Whrnb）的正常表达和定位。更重要的是，这些突变体斑马鱼表现出正常的视紫红质运输能力和与野生型无异的视网膜电图反应，证明视觉功能得到了完整保留。

为了验证这一策略在人类细胞中的可行性，研究团队在HEK293T细胞中成功实现了ADGRV1外显子40-42的CRISPR-Cas9介导的切除，为将来临床转化奠定了基础。这项研究发表于《Molecular Therapy Nucleic Acids》，不仅为ADGRV1相关视网膜色素变性提供了新的治疗思路，也展示了三维蛋白质结构预测在指导治疗性外显子切除策略中的重要作用。

关键技术方法

研究采用AlphaFold2进行人源和斑马鱼ADGRV1蛋白的三维结构预测；通过CRISPR-Cas9基因组编辑技术构建斑马鱼adgrv1^Δexon9和adgrv1^Δexon40-42突变模型；利用免疫组化分析蛋白表达与定位；采用电生理记录评估视网膜功能；在HEK293T细胞系中验证人基因组编辑可行性。

分析人类和斑马鱼ADGRV1蛋白质结构域架构

通过SMART二维和AlphaFold2三维结构预测对比，发现ADGRV1具有39个Calxβ结构域（非先前认为的35个）和一个未知半胱氨酸富集结构域，三维模型显示关键结构域以突出形式存在而非独立单元。

选择ADGRV1外显子9和外显子40-42作为外显子切除治疗靶点

基于二维预测选择外显子9（预期切除单个Calxβ结构域），基于三维预测选择外显子40-42（预测形成杂交Calxβ结构域），AlphaFold2模拟显示外显子9切除可能导致结构紊乱，而外显子40-42切除可形成功能型杂交结构域。

使用CRISPR-Cas9技术生成斑马鱼adgrv1^Δexon9和adgrv1^Δexon40-42缺失模型

通过设计靶向内含子的sgRNA，成功获得稳定遗传的斑马鱼系，RT-PCR和测序证实目标外显子在转录本中被精确删除。

adgrv1^Δexon40-42斑马鱼中外显子切除不影响Adgrv1蛋白在光感受器细胞纤周区的表达

免疫组化显示adgrv1^Δexon9突变体完全缺失蛋白表达，而adgrv1^Δexon40-42突变体蛋白表达量和细胞定位与野生型无异。

adgrv1^Δexon40-42斑马鱼中USH2复合体成员usherin和Whrnb的定位与野生型相当

蛋白定量分析表明USH2复合体组成蛋白在adgrv1^Δexon40-42突变体中的表达水平与野生型相似，显著高于adgrv1^rmc22无效突变体。

外显子切除不影响斑马鱼光感受器细胞中视紫红质的运输

免疫荧光显示adgrv1^Δexon40-42突变体与野生型同样具有正常的视紫红质外段定位，而adgrv1^rmc22突变体出现显著误定位现象。

外显子切除不影响斑马鱼视觉功能

视网膜电图记录显示adgrv1^Δexon40-42突变体在不同光强度刺激下的B波振幅与野生型无统计学差异，保持正常视觉功能。

HEK293T细胞中CRISPR-Cas9介导的ADGRV1外显子40-42基因组切除

双sgRNA共转染实现外显子40-42的高效切除，测序证实基因组水平删除成功，证明该策略在人类基因组中的可行性。

研究结论强调，外显子40-42切除策略能产生功能完整的ADGRV1缩短蛋白，维持USH2复合体功能和视觉传导通路正常运作。讨论部分指出三维结构预测相比传统二维分析能更准确预测外显子切除后果，突破"仅完整结构域可切除"的传统理念，扩展了治疗靶点选择范围。研究首次证实部分结构域切除后形成杂交Calxβ结构域的可行性，为ADGRV1相关视网膜色素变性和其他重复结构域蛋白相关疾病提供了新治疗范式，同时为CRISPR-Cas9和反义寡核苷酸(ASO)疗法的临床转化提供了重要理论依据和实践基础。