肌肉生长抑制素基因敲除鸡出生后骨骼肌纤维组成的动态变化及其对禽类肌肉发育机制的重构

本研究针对禽类肌肉生长抑制素(MSTN)缺失影响肌肉纤维类型转化的机制空白，通过CRISPR-Cas9技术构建MSTN-KO鸡模型，系统分析了孵化后不同发育阶段（0/10/18周）股二头肌(BF)纤维类型转化规律。研究发现MSTN缺失导致IIB型纤维显著增生伴I型纤维减少，并通过上调糖酵解通路基因和MyoD表达诱导代谢重组，为家禽育种提供了既能规避哺乳动物双肌症出生缺陷、又能提升产肉性能的精准遗传靶点。

　　

在畜禽育种领域，肌肉生长抑制素（Myostatin, MSTN）作为肌肉生长的负调控因子一直备受关注。虽然哺乳动物中MSTN缺失会导致典型的"双肌"表型，但关于禽类MSTN缺失如何影响出生后肌肉纤维类型转化的时空动态规律，仍存在显著的知识空白。解决这一问题对家禽产业具有重要意义——肌肉纤维特性直接关系到生长速率、饲料效率和肉质性状。当前商业肉鸡育种中快速生长品系的选育虽然提高了产肉量，但过度生长的IIB型糖酵解纤维优势也引发了肌病、肉质下降和代谢应激等问题。

为系统解析MSTN在禽类肌肉发育中的作用机制，韩国首尔大学的研究团队在《Poultry Science》发表了最新研究成果。他们利用CRISPR-Cas9技术构建了MSTN基因敲除（KO）鸡模型，通过多时间点（孵化时、10周、18周）的肌肉组织学分析、免疫荧光染色、ATP酶染色和NADH-TR染色等技术，结合基因表达谱分析，揭示了MSTN缺失对鸡骨骼肌纤维类型组成的出生后调控规律。

研究采用的关键技术包括：对野生型（WT）和MSTN-KO鸡的股二头肌（BF）和胸大肌（PM）组织进行冷冻切片制备；通过免疫荧光染色（使用S35抗慢肌球蛋白重链和F59抗快肌球蛋白重链抗体）区分I型和II型纤维；采用ATP酶染色（在pH 4.64和10.60条件下预孵育）和NADH-TR染色进行纤维分型；使用MitoTracker Red染色分析线粒体分布；通过实时定量PCR分析肌生成调节因子、纤维类型特异性标志基因和糖代谢相关基因的表达模式。

比较WT和MSTN-KO鸡的肌肉重量和肌纤维类型

研究发现，在孵化阶段，WT和KO鸡的BF和PM肌肉重量无显著差异，但到10周和18周时，KO鸡的肌肉重量显著增加。BF肌肉在10周时增加2倍，PM肌肉增加1.41倍。免疫荧光和组化分析显示，孵化时大多数肌纤维呈现均匀的NADH-TR染色强度，难以区分II型亚型，因此仅分为I型和II型。到10周和18周时，NADH脱氢酶活性在F59阳性纤维群体中清晰可见，强NADH-TR染色强度的纤维被分类为IIA型。

WT和MSTN-KO鸡BF肌纤维特性比较

肌纤维数量分析显示，MSTN-KO鸡的总纤维数（TNF）显著高于WT，孵化时、10周和18周的比率分别为1.60、1.44和1.43。雌性KO鸡的增生效应更为显著。WT和KO鸡的TNF在不同年龄保持一致，表明肌纤维数量在孵化前就已确定。

孵化时，WT和KO鸡的BF肌肉整体横截面积（CSA）无显著差异，但KO鸡的II型纤维总数增加1.72倍，I型纤维数量略有减少。KO鸡的I型纤维相对面积减少，II型纤维相对面积增加，II型纤维密度显著升高。

10周时，KO鸡的整个BF横截面积比WT高2.09倍。I型纤维分布显著减少，总数显著降低（WT: 846±148，KO: 516±63），尤其在雄性中更为明显。相反，IIB型纤维比例增加2.39倍，IIA型纤维保持不变。所有纤维类型的CSA均显著增加，I型纤维的肥大在雌性中特别明显。由于纤维增大，KO鸡中IIA型纤维的相对面积减少，而IIB型纤维的数量和CSA增加导致其相对面积升高。I型和IIA型纤维的肥大导致纤维密度降低。

18周时，KO鸡的整个BF面积比WT高1.81倍。I型纤维总数减少，IIB型纤维数量增加2.77倍。纤维数量和大小分析显示KO鸡存在I型纤维肥大和IIB型纤维的肥大与增生。相对面积和纤维密度在10周和18周组间具有可比性。

WT和MSTN-KO鸡BF组织中基因表达模式比较

基因表达分析显示，KO鸡中MyoD（1.22倍）、MyoG（1.64倍）和Pax7（1.23倍）表达显著上调，而Mrf4和desmin无显著差异。I型纤维特异性肌纤维蛋白基因（TNNC1、MYL2和ATP2A2）表达显著下调，II型纤维 predominant基因（TNNC2、MYL1、MYBPC2和CAPZA1）显著上调。

糖酵解相关基因全部上调：参与糖酵解初始步骤的PGM1、HK1和GPI分别上调2.14、1.87和1.51倍。LDHA表达增加2.90倍，而LDHB mRNA表达显著下调，表明KO肌肉更依赖无氧代谢而非氧化磷酸化产能。线粒体内的PDC（DLD、DLAT、PDHA2和PDHB）和PDK（PDK1、PDK3和PDK4）基因群均显著下调。

研究结论表明，MSTN缺失导致的肌纤维类型转变主要发生在胚胎期而非孵化后。虽然MSTN-KO鸡在出生时肌纤维直径较小且体重较低，但在生长期间保持一致的体重增加，最终发育出双肌表型。这种由营养摄入驱动的补偿性生长机制，使禽类避免了哺乳动物MSTN缺失常见的出生相关并发症。

讨论部分强调，MSTN通过调节生肌调节因子的转录网络负调控肌肉发育。MSTN缺失通过增强MyoD表达导致IIB型肌纤维数量增加，驱动代谢向糖酵解转变。与哺乳动物胚胎通过胎盘获得持续营养供应不同，禽类胚胎仅依赖卵内有限营养，这种营养限制条件下的细胞增生可能伴随细胞尺寸减小。

该研究发现MSTN-KO鸡在畜禽生产中具有显著优势：既能提高瘦肉生产效率，又避免了哺乳动物中出现的出生体重过大、难产、应激敏感性增加、繁殖力降低和新生儿存活率下降等问题。与MSTN突变鹌鹑的研究结果一致，这些禽类模型在所有年龄段都比WT更重，且在生长期间具有更低的饲料转化率，展示了高效的饲料利用和肌肉生产效率。因此，MSTN可作为选育具有优良生长性能家禽品种的宝贵遗传标记。