利用CRISPR/Cas9敲除BrDFR基因重定向花青素代谢通路培育高黄酮醇紫甘蓝新种质

本研究针对紫甘蓝中花青素代谢调控机制不清的问题，通过CRISPR/Cas9技术敲除二氢黄酮醇4-还原酶基因BrDFR，成功获得无转基因成分的突变体。研究发现BrDFR缺失导致花青素合成中断，代谢流向黄酮醇积累方向重定向，显著提升槲皮素和异鼠李素含量。该研究为创制功能型蔬菜新种质提供了重要遗传资源，对解析芸薹属植物类黄酮代谢调控网络具有重要理论价值。

　　

在东亚传统食品泡菜的主要原料——紫甘蓝中，紫色的形成主要归因于花青素的积累，这与植物中保守的类黄酮生物合成通路密切相关。然而，尽管二氢黄酮醇4-还原酶（dihydroflavonol 4-reductase, DFR）是花青素生物合成中的关键酶，但在芸薹属作物中其功能验证和调控机制仍不明确。特别是在二倍体芸薹属物种中，与拟南芥TT3基因同源的DFR基因的功能尚未通过遗传学实验得到证实，这阻碍了通过代谢工程手段改良芸薹属作物品质的进程。

为了解决这一问题，研究人员以紫色结球甘蓝（Brassica rapa subsp. pekinensis）为材料，聚焦于推定的DFR基因Bra027457。通过体外酶活实验证实了该基因编码的蛋白具有还原三种二氢黄酮醇底物的能力，并表现出对二氢山奈酚（dihydrokaempferol, DHK）的优先催化特性。更重要的是，研究团队利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，在紫色甘蓝自交系8267中成功敲除了Bra027457基因，获得了无转基因成分的纯合突变体。

这些突变体表现出完全绿色的表型，花青素积累完全缺失，从而证实了Bra027457就是调控甘蓝营养组织中花青素合成的关键BrDFR基因。代谢组学分析显示，BrDFR敲除突变体中槲皮素（quercetin, Q）、异鼠李素（isorhamnetin, IR）和二氢槲皮素（dihydroquercetin, DHQ）的含量显著增加。通过液相色谱-质谱联用技术，研究人员进一步鉴定出五种黄酮醇苷和一种DHQ苷，其中Q 3,7-di-O-glucoside和IR 3-O-(2′′′-O-feruloyl)sophoroside-7-O-glucoside是主要的积累物质。

这项研究不仅深化了我们对芸薹属物种类黄酮生物合成途径的理解，而且为甘蓝的品质改良提供了宝贵的遗传资源。通过代谢工程手段成功将花青素合成通路转向黄酮醇积累，为培育具有增强抗氧化能力的功能型蔬菜新品种开辟了新途径。

主要技术方法包括：从韩国Asia Seed公司提供的紫甘蓝和绿甘蓝自交系中提取基因组DNA和RNA；通过原核表达系统获得重组BrDFR蛋白并进行体外酶活测定；利用CRISPR/Cas9系统构建靶向BrDFR基因的编辑载体，通过农杆菌介导法转化紫色甘蓝品种8267；采用高效液相色谱（HPLC）和超高效液相色谱-电喷雾电离-四极杆-飞行时间质谱（UPLC-ESI-QTOF-MS）技术分析类黄酮代谢物；使用实时定量PCR（qPCR）分析基因表达模式；通过DPPH法测定抗氧化活性。

3.1. BrDFR的氨基酸序列和基因表达分析

研究人员从四个甘蓝自交系中分离得到Bra027457的编码序列，发现所有CDS与注册序列一致。启动子区分析显示紫色品种8267存在九个核苷酸变异。序列比对表明Brassicaceae物种的DFR高度保守，特别是NADPH结合域和底物结合域。表达分析发现Bra027457的表达与花青素积累呈正相关，且与bHLH转录因子BrTT8的表达模式相似。

3.2. 重组BrDFR蛋白的体外酶活测定

通过原核表达系统获得纯化的重组Bra027457蛋白，体外酶活实验表明该蛋白能够还原三种二氢黄酮醇底物，酶活顺序为DHK > DHQ > DHM，活性分别为273、78和28 pkat·mg^?1。

3.3. 无转基因纯合BrDFR-KO植株的获得

利用CRISPR/Cas9系统设计两个sgRNA靶向BrDFR基因的第一和第二外显子，通过农杆菌转化获得T0代植株。通过自交和分子鉴定，在T1代中筛选到无转基因成分的纯合突变株系，这些突变导致翻译提前终止。

3.4. BrDFR-KO甘蓝的表型分析

突变体植株表现出完全绿色表型，花青素完全缺失，但其他农艺性状保持8267背景特征。种子颜色变为浅金棕色，表明可能存在另一个DFR基因负责种皮中的原花青素积累。

3.5. BrDFR-KO植株中类黄酮苷的鉴定

LC-ESI-QTOF-MS分析鉴定出六种类黄酮苷，包括三种槲皮素苷、两种异鼠李素苷和一种DHQ单糖苷，其中Q 3,7-di-O-glucoside和IR 3-O-(2′′′-O-feruloyl)sophoroside-7-O-glucoside是主要成分。

3.6. BrDFR-KO甘蓝的基因表达分析

qPCR结果显示BrDFR、BrANS1和BrTT8在突变体中显著下调，而BrFLS1强烈上调，BrF3′H表达基本不受影响，这与代谢物积累模式一致。

3.7. BrDFR-KO甘蓝的抗氧化能力增强

DPPH测定表明突变体的抗氧化能力显著高于紫色品种8267和绿色品种8045，说明独特的类黄酮组成增强了其抗氧化活性。

研究结论表明，Bra027457是甘蓝营养组织中花青素生物合成的关键DFR基因。通过CRISPR/Cas9技术成功敲除该基因，实现了代谢流从花青素向黄酮醇的重定向，获得了富含槲皮素和异鼠李素的新型甘蓝材料。这些突变体不仅保持了优良的农艺性状，而且表现出增强的抗氧化能力，为功能型蔬菜育种提供了有价值的种质资源。

讨论部分指出，芸薹属物种在从拟南芥分化后经历了全基因组三倍化事件，随后二倍化过程导致了TT3基因额外拷贝的丢失，在二倍体芸薹属物种中只保留了一个同线性的DFR基因。研究发现绿色表型品种5546具有完整的BrDFR位点，表明其绿色性状可能由MYB转录因子缺陷引起。BrDFR对DHK的底物偏好性可能反映了在DFR和FLS竞争中的策略性选择。研究表明BrDFR-KO植株中代谢通量的重定向导致黄酮醇大量积累，但总类黄酮含量相比紫色背景有所下降，这可能与过量黄酮醇苷元引起的反馈抑制有关。

这项研究为芸薹属作物类黄酮代谢调控提供了重要见解，展示了基因组编辑技术在作物品质改良中的巨大潜力，为培育具有增强健康促进功能的新型蔬菜品种奠定了坚实基础。