利用CRISPR/Cas9技术实现叙利亚仓鼠基因敲入——突破胚胎操作瓶颈并建立冷冻胚胎复苏技术

本研究首次通过CRISPR/Cas9介导的受精卵原核显微注射技术，成功在叙利亚仓鼠（Mesocricetus auratus）ROSA26同源位点实现长达8 kb的基因敲入（KI），并证实该位点具有转录活性。研究还建立了适用于仓鼠胚胎的简化冷冻复苏方案，为这种具有独特生理学特征的模式生物提供了可靠的基因工程技术平台，显著拓展了其在生物医学研究中的应用潜力。

　　

1 引言

叙利亚仓鼠（Mesocricetus auratus）因其独特的生物学特性——规律的四天性周期、短暂的16天妊娠期以及对人类疾病特有的药理学反应，长期以来在肿瘤学、免疫学和生理学研究中被视为重要模型动物。尽管胚胎操作技术如胚胎采集、原核显微注射和胚胎移植已在仓鼠中建立，但基因敲入（KI）仓鼠至今未见报道。仓鼠胚胎对体外环境异常敏感，甚至短暂暴露于人工光源即可导致2细胞期发育停滞，这成为基因编辑技术应用的主要障碍。

2 材料与方法

2.1 动物

实验使用SPF级金色叙利亚仓鼠，在严格控制的光照（7:00-21:00）、温度（22°C±2°C）和湿度（40%-60%）条件下饲养。

2.2 胚胎操作环境

所有胚胎操作均在低于8 Lx照度的红光LED暗室中进行。显微镜配备可阻断600 nm以下波长的红色滤光片，以最大限度减少光损伤。

2.3 受精卵采集

通过自然交配获取受精卵，用含0.1%透明质酸酶的HECM-9培养基从输卵管中冲洗获得原核期受精卵。

2.4 供体载体构建

通过生物信息学分析确定仓鼠ROSA26同源位点（shROSA26），位于Setd5和Thumpd3基因之间。构建了包含CAG启动子、loxP-flanked STOP序列、H2B-Scarlet报告基因、WPRE元件和bpA信号的不同尺寸KI载体（1.4-8.0 kb）。

2.5 RNA合成

针对shROSA26位点设计两个crRNA（R26-crRNA1和R26-crRNA2），与tracrRNA形成ctRNP复合物。

2.6 显微注射

将Cas9蛋白（100 ng/μl）、crRNAs（各50 ng/μl）、tracrRNA（200 ng/μl）和供体质粒（10 ng/μl）的混合液注射入受精卵雄原核，使用压电驱动系统减少细胞损伤。

2.7 胚胎移植

注射后胚胎移植到假孕受体输卵管中，术后提供水琼脂和特殊饲料以减少幼崽被吞噬风险。

2.8 胚胎成像

E9.5和E12.5胚胎使用配备RFP滤光片（激发：545/30 nm，发射：620/60 nm）的立体显微镜成像。

2.9 基因组DNA分析

通过多重PCR引物系统（P1-P10）鉴定KI阳性个体，检测5'和3'同源臂整合情况。

2.10 胚胎冷冻复苏

分别采用小鼠和大鼠建立的胚胎冷冻方案。大鼠方案显示更好效果：胚胎在P10培养基中平衡后，加入预冷的PEPeS冷冻保护剂，直接投入液氮。复苏时使用0.25 M蔗糖溶液逐步脱除保护剂。

3 结果

3.1 条件性报告基因KI的成功建立

在三轮显微注射实验中，共移植475枚胚胎，获得49只幼崽，其中8只经PCR证实为正确KI（最高效率28%）。F1代杂交证实成功种系传递，纯合子KI仓鼠发育正常。Cre mRNA注射实验证明STOP序列可被有效切除，实现Scarlet的 ubiquitous表达。

3.2 shROSA26位点的启动子活性验证

通过启动子缺失的H2B-Scarlet载体（2.2 kb）成功获得全身表达Scarlet的E12.5胚胎，证实该位点具有内源性启动子活性。

3.3 其他位点的KI效率比较

在不同基因组位点（CDB0001H-CDB0003H）的KI实验显示，插入片段大小显著影响效率：8.0 kb插入的效率为16.7%，而1.4 kb插入效率可达53.5%-53.8%。

3.4 胚胎冷冻技术的成功应用

比较研究表明，大鼠冷冻方案更适合仓鼠胚胎，出生率达21.3%±3.3，显著高于小鼠方案（12.6%±3.0）。应用大鼠方案成功复苏了R26R-CAG-H2B-Scarlet KI胚胎，获得18.6%±1.6的出生率。

4 讨论

本研究首次建立了叙利亚仓鼠的高效KI技术平台，突破了该物种长期以来无法实现基因敲入的技术瓶颈。成功证实shROSA26位点可作为安全港位点用于稳定转基因表达，为后续条件性基因操作、 lineage tracing和活体成像研究奠定了基础。建立的简化冷冻复苏方案使得基因工程仓鼠品系的保种和共享成为可能，将显著推动仓鼠在生物医学研究中的广泛应用。虽然目前妊娠率（39.4%）仍低于对照组，但该技术平台为未来开发更高效的基因编辑方案提供了重要基础。