单链DNA供体修复模板结合CRISPR/Cas9实现马铃薯高频靶向插入：结构优化与修复机制解析

本研究通过原生质体转染与高通量测序技术，系统分析了供体修复模板（DRT）结构对马铃薯同源定向修复（HDR）效率的影响。发现单链DNA（ssDNA）以靶向链取向（ss-T）配合短同源臂（30 nt）可实现最高效的靶向插入（24.89%），且HDR效率与同源臂长度无关。研究揭示了非同源末端连接（NHEJ）抑制剂在植物中的局限性，并为作物精准编辑提供了优化策略。

　　

1 引言

马铃薯（Solanum tuberosum L.）作为全球重要粮食作物，面临气候变化带来的生物与非生物胁迫挑战。传统育种受限于其四倍体遗传特性、高杂合度和近交衰退。CRISPR/Cas9系统通过向导RNA（sgRNA）介导的Cas9核酸酶在特定位点产生双链断裂（DSB），为作物遗传改良提供了精准工具。DSB主要通过易错的非同源末端连接（NHEJ）修复，导致小片段插入或缺失（indels）；若存在微同源区域，则触发微同源介导末端连接（MMEJ），产生更大缺失。然而，许多农艺性状需要精确的编码区或调控区修饰，而非简单基因敲除。

当存在供体修复模板（DRT）时，可激活同源定向修复（HDR）途径，实现精确插入或替换。DRT设计包含目标插入片段和侧翼同源臂（HAs），以促进编辑整合。尽管HDR介导的基因编辑已在马铃薯等植物中实现，但其效率仍较低，部分原因是HDR仅限于细胞周期的S和G2期，而NHEJ在整个周期均活跃。此外，DSB诱导效率低和DRT在DSB附近可用性差也限制了HDR激活。

为提高植物HDR效率，研究聚焦于创造有利于HDR的条件并增加局部DRT可用性。动物模型中DRT结构显著影响HDR效率，关键因素包括同源臂长度、同源臂与插入片段的比例、DRT分子的链性（单链ssDNA vs. 双链dsDNA）以及ssDNA分子的序列取向。例如，小鼠系统中dsDNA供体的HDR效率随同源臂从200 bp延长至2000 bp而急剧增加；人类细胞中同源臂从50 bp延伸至900 bp时HDR效率逐渐提高，但短至50 bp的序列仍可实现6%–10%的HDR效率。使用ssDNA作为供体时，即使短同源臂（50–100 nt）也能实现高HDR效率（8.5%至100%），甚至在大型插入（>800碱基）时也是如此。斑马鱼中ssDNA在HDR介导的编辑中优于dsDNA，即使使用40 nt同源臂。

ssDNA分子作为DRT时，有两种可能取向相对于sgRNA识别序列：“靶向”取向与sgRNA识别的链重合，而“非靶向”取向对应含PAM序列的反链。动物研究中取向偏好可能因靶位点及其序列而异，但植物中尚未对此参数进行实证分析。

尽管动物模型中有广泛研究，但植物中DRT结构及其对HDR效率影响的研究仍有限。本工作通过核糖核蛋白（RNP）/DRT转染马铃薯原生质体，结合高通量测序（NGS）精确量化编辑结果，探究DRT结构如何影响马铃薯HDR效率。

2 结果

2.1 靶位点选择影响切割效率

有效HDR策略的第一步是在靶位点诱导DSB。由于更高频率的DSB可提高HDR效率，且DSB诱导效率主要取决于sgRNA选择，本研究测试了四个靶向马铃薯品种Kuras中可溶性淀粉合成酶1（SS1）基因不同位点的sgRNA。Kuras作为四倍体栽培种，每个位点有四个等位基因。靶位点T13在所有四个SS1等位基因中保守，而T7和T12存在于四个等位基因中的两个，T17存在于三个等位基因。

通过原生质体转染和NGS分析，量化仅含相应靶位点的等位基因的诱变频率，发现靶向诱变效率因sgRNA而异。T7的平均频率最高（74.19%），其次是T12（63.26%）和T17（56.73%），T13的平均诱变频率（3.82%）与阴性对照（2.92%）无显著差异。高等等位基因变异阻止了T7和T12在交替等位基因上的诱变，但T17的sgRNA对两种类型SS1等位基因均有效，诱导DSB频率在48.76%至56.73%之间。因此选择靶向T17的sgRNA用于后续分析。

靶向诱变可能源于NHEJ和/或MMEJ机制，分析T17的突变结果中高度预测的MMEJ模式，发现至少21.51%的突变模式与MMEJ一致。

2.2 供体修复模板（DRT）结构影响HDR效率

为评估同源臂长度、供体分子链数和ssDNA分子序列取向对马铃薯HDR效率的影响，设计了九种不同DRT，在T17靶位点插入六碱基对BamHI限制位点（5′-GGATCC-3′）。插入片段侧翼为30、50或97 nt的同源臂，每个供体测试为dsDNA或ssDNA，后者以靶向（ss-T）或非靶向（ss-NT）链取向提供。

使用原生质体转染和NGS分析确定同源臂长度和链选择的影响。发现ss-T在所有同源臂长度中始终优于其他供体类型，平均HDR效率在总分析读数的0.40%至1.12%之间。双因素方差分析显示同源臂长度对HDR效率无显著影响，而供体链选择有高度显著影响。

为探究不同供体间HDR效率差异是否由CRISPR/Cas9活性变化解释，量化了数据集中的靶向诱变频率。使用ss-T和ss-NT供体的实验诱变频率统计相同，但使用dsDNA供体的实验显著降低。例如，携带30 nt同源臂的DRT中，ss-T和ss-NT的平均靶向诱变分别为88.75%和95.15%，dsDNA分子为37.88%。dsDNA分子在50和97 nt同源臂时也观察到显著降低的靶向诱变。

当DRT可用时，插入也可通过NHEJ或MMEJ等替代修复途径发生。量化了含有所需插入片段的读数频率（无论侧翼同源臂的完美重组如何），这些事件称为“靶向插入”。靶向插入的模式与HDR相似，ss-T供体在所有同源臂长度中产生最高插入频率。有趣的是，双因素方差分析表明同源臂长度和链选择均显著影响靶向插入频率。较短同源臂（30 nt）导致最高靶向插入频率，其次是50和97 nt同源臂。携带30 nt同源臂的ss-T供体产生最高靶向插入频率，达总读数的24.89%，比相同供体的HDR效率提高31倍。

通过大小分布可区分源自NHEJ和MMEJ的靶向插入。为进一步表征使用30 nt同源臂ss-T供体获得的高频插入，分析了测序数据中的插入大小和谱。绝大多数插入长度为10–30 nt，主要由靶位点5′同源臂的部分重复引起。相比之下，等效dsDNA供体的分析揭示了更大的插入（≥60 nt），由两个同源臂的完全重复及反向取向重复引起。

总之，分析表明DRT结构显著影响HDR效率，靶向链取向的ssDNA优于所有其他结构。此外，由替代修复机制介导的靶向插入在马铃薯中以远高于HDR的频率发生，且似乎受较短同源臂的青睐。

2.3 化学抑制剂不影响非同源末端连接（NHEJ）

鉴于HDR效率与含有靶向插入的读数频率之间存在显著差异，接下来评估了一组据报道在动物系统中抑制NHEJ的小分子，以确定阻断此替代修复途径是否能提高HDR介导的精确插入频率。测试的抑制剂包括组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂曲古抑菌素A（TSA）、DNA依赖性蛋白激酶催化亚基（DNA-PKcs）抑制剂NU7441和Alt-R HDR Enhancer V2。

使用最有效的供体构建体（携带30 nt同源臂的ss-T）转染马铃薯原生质体，并在生长培养基中培养48小时，培养基补充每种抑制剂。首先通过量化显示靶向诱变的读数频率评估NHEJ活性是否受不同抑制剂影响。与预期相反，抑制剂处理与对照原生质体之间未观察到靶向诱变的显著差异。此外，为排除突变谱的潜在变化，进一步分析了数据集中MMEJ兼容突变的发生率。 again，抑制剂处理与对照原生质体之间未检测到差异。与这些结果一致，处理间未观察到HDR效率或靶向插入的积极影响。

这些结果表明，在实验条件下，测试的抑制剂未抑制NHEJ，因此未提高HDR频率。

2.4 截短Cas9靶位点（CTS）的掺入降低马铃薯HDR效率

增强DRT对细胞修复机制的可用性是提高HDR效率的可行策略。在人类细胞中，通过在DRT两端加入截短Cas9靶位点（CTS）成功增强了HDR。这些截短位点被Cas9识别，促进RNP-DRT复合物形成，并促进核内共定位，从而增加HDR介导修复的可能性。CTS-DRT可作为完整dsDNA分子（CTS-ds）或混合分子递送，后者由ssDNA供体组成，两侧短dsDNA区域含CTS。

为评估此策略在马铃薯中的效果，在SS1基因编辑中最有效的供体（携带30 nt同源臂）两端加入CTS，创建dsDNA（CTS-ds30）和杂交（CTS-ssT30）供体。每种供体在原生质体中评估，并与无CTS的相应对照比较。使用杂交CTS-ssT30导致HDR效率为0.0019%，显著低于对照（0.3706%）。靶向插入也获得类似减少，CTS-ssT30结果为0.19%靶向插入，显著低于对照的14.11%。尽管无统计学显著差异，但CTS-ds30与相应无CTS对照的HDR效率和靶向插入观察到相同趋势。

此外，靶向诱变频率分析显示CTS掺入后一致降低，表明CRISPR/Cas9活性整体下降。结果与HDR效率和靶向插入镜像，使用CTS-ssT30显示靶向诱变相较于对照显著减少，CTS-ds30显示显著较低的靶向诱变，尽管与对照无统计学显著差异。

collectively，这些发现表明，在马铃薯供体分子中掺入截短Cas9靶位点对基因组编辑结果产生负面影响。在本系统中，CTS-DRT似乎降低了HDR效率和靶向插入频率，可能由于CRISPR/Cas9活性减弱。

2.5 靶位点选择影响ssDNA供体介导的HDR效率

靶向SS1基因座的结果显示ssDNA供体导致更高HDR效率，且明显偏好靶向链取向供体（ss-T供体）而非非靶向链取向供体（ss-NT供体）。为进一步探究此观察的普遍性，靶向了马铃薯中三个额外基因座：EID1（empfindlicher im dunkelroten licht 1）、LNK2（night light–inducible and clock-regulated gene 2）和SES（suppressor of SP6A expression）。

为每个靶基因选择高效sgRNA，DRT设计含BamHI限制位点作为插入片段，侧翼为30 nt同源臂。在EID1和SES，发现与SS1观察一致，使用ss-T供体获得最高HDR效率（分别为3.15%和0.22%）。此外，ss-T供体导致更高靶向插入频率，EID1和SES分别达总读数的9.62%和12.50%。相反，靶向LNK2时使用ss-NT或dsDNA供体产生更高HDR效率，平均达2.54%和4.99%。然而，LNK2靶向插入频率分析显示三种DRT结构间无显著差异。

为分析整体CRISPR/Cas9活性变化是否可解释不同靶位点HDR效率差异，分析了数据集中的靶向诱变。与先前SS1分析一致，使用dsDNA供体时诱变频率系统降低。

总之，这些结果表明最大化HDR效率的最佳链选择在马铃薯中呈基因座依赖性。然而，在大多数测试基因座中，ss-T供体始终导致最高HDR效率，与SS1先前结果一致，突出可能为该物种未来基因组编辑策略提供信息的一般趋势。

3 讨论

CRISPR/Cas9系统基因编辑是遗传工程的强大工具，显著加速多种作物物种农艺重要性状的改良。HDR可介导精确变化，但其在体细胞植物细胞中的效率仍低。本研究调查了可能有利于马铃薯中HDR介导基因编辑的条件，使用原生质体转染系统结合NGS分析。

由于DSB诱导是HDR的必要起始步骤，且植物中HDR效率与DSB频率正相关，首先评估了四个靶向SS1基因的不同sgRNA。编辑效率显著变化，从 guide T13的3.82%（与模拟对照统计无区别）到 guide T7的74.19%。这些结果强调sgRNA选择对编辑效率的既定影响。尽管各种生物信息学工具可预测sgRNA效能，但预测常与实验结果分歧。此观察在植物基因编辑应用中更为明显，因为大多数效率预测因子使用动物模型经验数据训练。发现重申sgRNA性能最好通过经验验证，本研究中原生质体转染和NGS分析代表此努力的快速可靠方法。

由于所用马铃薯品种的四倍体性质和SS1靶向区域的高等等位基因变异性，仅设计在T13的sgRNA匹配所有四个等位基因。相反，靶向T7和T12的sgRNA未预测结合任何交替等位基因，经实验证实。设计在T17的sgRNA靶向含一个单核苷酸多态性（SNP）的区域，位于一个等位基因中PAM远端。有趣的是，测序数据显示T17编辑所有四个等位基因效率相当，包括含SNP等位基因。这支持先前发现即Cas9耐受PAM远端的单个错配，突出在具等等位基因变异区域选择sgRNA的影响以及高相似基因座中潜在脱靶效应预测。

除高效DSB诱导外，HDR还需要携带所需插入片段的DRT。尽管在动物模型中有广泛研究，但DRT结构对植物HDR效率影响的理解仍贫乏。先前报告使用N. benthamiana原生质体，检查同源臂长度如何影响HDR。该研究中其他DRT参数恒定，因为所有情况均使用靶向取向的ssDNA分子。此外，HDR效率通过基于GFP活性恢复的报道系统确定， upon HDR介导其编码序列编辑。虽然对便易廉价分析不同HDR组件效率极具价值，但通过高通量测序更彻底分析可能更准确表征结果，允许不同策略间精确比较。数据显示马铃薯中HDR效率受DRT结构影响，靶向链取向匹配的ssDNA供体（ss-T供体）在四个测试基因座中的三个优于其他结构。值得注意的是，对于SS1靶位点，这在变化同源臂长度间一致，如双因素方差分析结果所示。此结果表明对于ss-T供体，短至30 nt的同源臂足以介导HDR，与N. benthamiana报告发现一致。然而，本研究限制于固定插入长度，留下30 nt同源臂与插入片段比例如何影响HDR效率的问题未解。

ssDNA供体在多种动物系统中通常比dsDNA更有效，如斑马鱼和哺乳动物细胞。增加效率常归因于合成依赖链退火（SDSA）机制，仅需短同源序列（30–40 nt）触发精确插入。相反，使用dsDNA供体的HDR通常需要长得多的同源臂（0.5–1 kb）。也普遍接受ssDNA代表比dsDNA细胞毒性更小的供体 cargo 用于动物细胞。虽然需要进一步调查确定这些因素是否影响ssDNA在马铃薯中的性能，但数据表明当dsDNA供体包含在转染中时靶向诱变一致减少。此观察可能由两个非互斥场景解释。第一，dsDNA供体的存在可能降低整体CRISPR/Cas9活性。这些条件下DSB率较低将直接降低HDR效率。一种可能解释是转染前RNP复合物与dsDNA供体间的体外相互作用，可能干扰细胞内靶DNA interrogation。为测试此假设，通过载体递送CRISPR/Cas9组件可能帮助防止潜在转染前相互作用。或者，减少的靶向诱变可能源于dsDNA相关细胞毒性，如动物系统中广泛报道。此假设可通过评估靶基因座PCR扩增前原生质体存活率评估。这些场景假设与本系统相关特定供体的转染效率变化可忽略。

关于ssDNA链取向，ss-T供体在本研究中通常更有效，与基于Cas9切割动力学的先前提议一致。多项使用生化、结构和单分子方法的研究支持非靶链通常先被切割和释放，这将使其更易与互补ssDNA供体相互作用用于HDR。数据支持此，ss-T供体在四个基因座中的三个优于。重要的是，这些差异不仅由于整体CRISPR/Cas9活性，因为对于SS1，ss-T和ss-NT供体观察到相似靶向诱变频率，而对于EID1和SES基因，使用ss-NT供体的实验甚至更高靶向诱变。然而，LNK2靶位点不一致链偏好表明这可能非通用规则，与动物系统中一些观察一致。

当DRT可用时，插入也可通过非HDR途径如NHEJ或MMEJ发生。对含有所需插入片段的读数分析（无论完美同源臂重组如何）（“靶向插入”）表明这些事件在马铃薯基因组中相对频繁结果。使用带30 nt同源臂的ss-T供体，观察到SS1、EID1、LNK2和SES平均靶向插入频率分别为24.89%、9.62%、2.83%和12.50%，而相应HDR效率低得多（分别为0.80%、3.15%、1.25%和0.22%）。ss-NT和dsDNA供体见相似趋势。此外，靶向SS1的分析表明靶向插入频率随供体分子长度减少而增加。尽管量化靶向插入的方法包括HDR介导事件，但为每个靶位点确定的两个参数值间差异提供明确指示即大多数获得的插入由不精确或替代修复机制介导，而非完美重组修复。使用ssDNA供体的高频靶向插入也在N. benthamiana原生质体中报告。通过使用ss-NT供体，作者基于单细胞基因型分析报告靶向插入达频率10.5%–13.6%。此外，对转染原生质体进行的植物再生导致29.3%–31.8%植物携带靶向插入，而仅一株再生植物（分析总数8.3%）显示HDR介导的精确插入。

确定带30 nt同源臂ss-T供体高频靶向插入的确切修复机制超出本研究范围。然而，对SS1靶基因的分析表明与MMEJ途径兼容。此途径特征包括DSB诱导后缺失连接处存在微同源，导致由这些微同源“引导”的缺失模式，以及通过以短同源序列为模板的DNA合成产生的插入，尽管保真度低于HDR。此外，植物中报告了MMEJ介导的高频插入。来自本研究的两条证据支持MMEJ参与介导SS1中带30 nt同源臂ss-T供体的靶向插入。第一，MMEJ兼容突变（即侧翼微同源的缺失）在靶向T17位点SS1实验的所有突变读数中显著部分观察到。这表明MMEJ可能 actively 修复马铃薯中的DSB，如其他植物物种观察。第二，包括ss-T供体的转染主要产生短于全供体长度（66 nt）的插入（10–30 nt），由于侧翼同源臂的部分重复。此结果与短同源臂区域与靶位点间不精确碱基配对兼容，随后DNA合成，导致靶基因座不完全供体掺入。相比之下，等效dsDNA供体的分析揭示了更接近全供体序列的插入长度更高流行，表明这些事件大多数可能由NHEJ途径介导。同样，在Setaria viridis中，dsDNA短供体导致原生质体中高达51.1%靶向插入，其大小匹配完全同源臂重复，指出绝大多数由NHEJ机制介导。然而，仅基于编辑结果推断确切机制仍具挑战性，需要进一步研究工作以确定本研究中观察到的靶向插入背后的精确分子机制，可能使用特定途径缺陷植物。

为解决HDR与靶向插入间差异，测试了马铃薯原生质体中NHEJ的化学抑制，作为在SS1基因座增强HDR的策略。与NHEJ的遗传抑制相反，修复机制的化学调制在植物中未广泛研究。一种测试分子NU7441，广泛用于动物系统抑制在经典NHEJ机制中作用的DNA依赖性蛋白激酶（DNA-PKcs），导致增加HDR。尽管未描述DNA-PKs的植物同源物，NU7441先前以1 μM浓度应用于番茄愈伤组织再生以增强该物种HDR效率，尽管有效性中等。此先前证据促使我们在原生质体系统中测试不同浓度NU7441。与其在植物中靶向元素缺失一致，添加NU7441到原生质体培养基浓度0.5、1或5 μM未显著影响SS1基因座HDR效率。此外，与其先前在番茄应用一致，测试浓度中无一导致对NHEJ机制的负面影响，在本研究中由靶向诱变量化和突变谱分析代表。这些结果表明添加NU7441到培养基不是调节马铃薯DNA修复的可行策略，至少对于评估浓度。

也测试了Alt-R HDR Enhancer V2，一般描述为NHEJ抑制剂，和TSA，一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂。Alt-R HDR Enhancer V2，在动物系统中有效，在本原生质体系统中无可检测影响靶向诱变或HDR效率。在变化浓度进一步测试，而非如这里使用遵循制造商推荐，可能澄清剂量或植物特定因素是否限制其效能。关于TSA，尽管一般描述为NHEJ抑制剂，它显示对DNA修复调制的混合效应。例如，在人类细胞中TSA通过抑制关键因子如Ku70和Ku80的脱乙酰化干扰NHEJ机制，限制它们对DSB的访问。此外，TSA增加动物细胞细胞周期G2期持续时间，贡献更高HDR效率。相反，在无供体分子时，TSA增加动物细胞中的靶向诱变，可能由于CRISPR/Cas9组件更高可访问性 due to 靶位点开放染色质状态，和替代末端连接修复机制激活。先前本研究，浓度0.1 μM–10 μM TSA增加莴苣和烟草原生质体中的靶向诱变率，可能通过染色质松弛增强RNP访问。这里，我们在马铃薯测试各种浓度TSA和在供体分子存在下。然而，测试浓度未显著影响靶向诱变或HDR。由于TSA对基因组编辑影响可能取决于特定靶位点基础染色质状态，先前在莴苣和烟草报告的更高靶向诱变可能不推广到所有基因座。鉴于其在其他系统中的有希望用途和在其他植物系统中更高CRISPR/Cas9活性观察，TSA的额外调查在马铃薯中相关。总之，我们使用具有修复机制调制潜在效应的化学分子结果提供证据直接翻译动物研究中验证策略仍具挑战性，可能由于植物系统中操作组件和分子机制差异。

在进一步尝试增强HDR效率中，调查了增加SS1基因编辑局部DRT可用性的策略。为此，在供体分子同源臂末端掺入截短Cas9靶位点（CTS）。此方法先前显示在转染dsDNA供体的人类细胞中增加HDR效率达三倍，并也成功应用于ssDNA供体。在人类细胞中，包含靶序列16 bp的CTS允许Cas9结合但不切割DRT，从而通过与RNP复合物共转运增强其核定位。相反，在设计用于SS1基因座的30 nt同源臂末端包含CTS在ss-T供体中显著降低HDR效率。相应dsDNA供体观察到类似减少，尽管此案例与对照差异无统计学显著。基于靶向诱变分析，得出结论CTS包含减少整体CRISPR/Cas9活性。在人类细胞中此策略先前应用，RNP复合物与含CTSDRT预孵育对于实现高HDR效率必要。这可能由于需要形成RNP与含CTSDRT间稳定相互作用，使它们联合转运入核。在本研究中，此类相互作用可能干扰马铃薯基因组靶位点Cas9活性，可能由于竞争结合或位阻。此观察支持我们早先关于dsDNA供体与Cas9间转染前潜在有害相互作用假设。此外，其他作者提示了在策略中将供体分子拴系到RNP复合物可能降低DNA切割效率。在水稻中探索了增强局部DRT可用性的替代成功策略，如使用作为sgRNA延伸的RNA供体分子，或融合Agrobacterium衍生VirD2蛋白到Cas9，使ssDNA供体拴系到编辑复合物。尽管在本系统中观察到减少效能，CTS基于供体在人类细胞中证明成功及其与RNP基于、无转基因编辑策略兼容性表明此方法进一步优化仍可能持有提高马铃薯基因编辑效率希望。为此， employment 失活dCas9变体融合到含CTS供体，同时保持靶向期望基因RNP复合物转染前无任何相互作用，可能是测试策略。

4 结论

本研究探索了可能有利于马铃薯中HDR介导基因编辑的条件。采用原生质体与NGS组合为快速评估基因编辑组件和下游应用条件提供有效平台。此平台一主要瓶颈是高质量原生质体分离，通常认为劳动密集型。然而