高效原生质体再生与转染方案提升埃塞俄比亚芥（Brassica carinata）CRISPR基因组编辑效率的研究

本研究开发了一种针对埃塞俄比亚芥（Brassica carinata）的高效原生质体再生与转染方案，通过系统优化基因型、渗透压调节剂（如甘露醇）、植物生长调节剂（PGRs，包括NAA、2,4-D、TDZ）组合及培养时间等关键因素，成功实现最高64%的再生频率和40%的转染效率。该方案为CRISPR/Cas9无DNA编辑技术在该油料作物中的应用提供了可靠平台，显著推进了其遗传改良和功能基因组学研究。

　　

引言

Brassica carinata（埃塞俄比亚芥）是一种重要的油料作物，具有显著的食品和工业应用潜力。CRISPR/Cas9基因组编辑工具在该物种中的应用可加速其育种进程。然而，目前缺乏高效的无DNA编辑方法。基于原生质体的CRISPR编辑虽具有潜力，但在许多作物中仍面临挑战，尤其是原生质体再生体系尚未完善。本研究旨在系统研究影响埃塞俄比亚芥原生质体再生的关键因素，并开发高效再生与转染方案。

材料与方法

研究使用三个基因型的埃塞俄比亚芥种子（G1、G2、G3），其中G1和G3用于大部分实验。种子经表面灭菌后播种于发芽培养基，在可控气候室中培养。原生质体分离参照Li等（2021）的方案，使用完全展开的叶片，经酶解（纤维素酶Onozuka? R10和Macerozyme? R10）后过滤和纯化。原生质体嵌入藻酸盐磁盘，并培养于五阶段培养基体系（MI至MV）。

MI培养基用于促进细胞壁形成，含高浓度NAA和2,4-D（各0.5 mg L^-1）。MII培养基用于刺激细胞分裂和愈伤组织形成，含TDZ（1.1 mg L^-1）和低浓度2,4-D（0.05 mg L^-1）。MIII为固体培养基，用于愈伤组织生长和芽诱导，含甘露醇（50 g L^-1）和PGRs（如TDZ与NAA组合）。MIV用于芽再生，含高细胞分裂素与生长素比例。MV用于芽伸长，含低浓度BAP和GA₃。

转染效率测试使用含GFP标记基因的载体，通过PEG介导的转染，48小时后通过共聚焦显微镜观察GFP表达。统计分析使用ANOVA和Tukey检验。

结果

基因型对再生效率有显著影响。G1表现最高再生频率（64%），G2和G3分别为31%和26%。

MII培养基中甘露醇浓度至关重要：100 g L^-1支持再生，较低浓度则无效。

MII培养时间显著影响再生：G1最优为25-30天，G3为20-30天；超过40天则频率急剧下降。

MIII培养基中甘露醇（50 g L^-1）必不可少，去除则再生频率降低。PGR组合（如TDZ与NAA）对愈伤组织生长和再生无显著差异，但培养时间以20天为优，超过40天则下降。

MIV培养基中，蔗糖作为碳源优于葡萄糖，30 g L^-1蔗糖产生更高再生频率。PGR组合中，TDZ与NAA组合效果最佳，而BAP无效。

转染效率达40%，使用25% PEG4000和40 μg载体DNA。

讨论

原生质体再生是一个多阶段过程，需精确调控物理、化学和生物因素。MI阶段高浓度生长素（2,4-D和NAA）对细胞壁形成和存活至关重要。MII阶段需高细胞分裂素与生长素比例以促进分裂。渗透压调节（甘露醇）在早期关键，逐步降低浓度以支持正常生长。培养时间需根据基因型调整，避免愈伤组织老化。TDZ在芽再生中高效，但物种响应差异显著（如与甘蓝型油菜不同）。该方案为CRISPR无DNA编辑提供了可行路径，有望产生非转基因突变体，促进作物改良。