综述：基于CRISPR/Cas的肿瘤生物标志物检测策略

本综述系统阐述了基于CRISPR/Cas系统的肿瘤生物标志物检测新策略，重点介绍了其高灵敏度、高特异性、简易操作性和灵活可编程性优势，并详述了其与等温扩增技术结合实现多重检测的潜力，为肿瘤早期诊断与监测提供了创新技术方向。

　　

CRISPR/Cas系统分类与工作机制

CRISPR/Cas系统作为原核生物的适应性免疫机制，已被开发为高效的分子检测工具。根据效应蛋白复合物的差异，主要分为两大类：Class 1（包含I、III、IV型）使用多蛋白复合物，而Class 2（包含II、V、VI型）依赖单一效应蛋白。其中II型Cas9、V型Cas12a/Cas12b和VI型Cas13a/Cas13d因其操作简便性和高效率被广泛应用于生物传感领域。Cas9通过向导RNA（gRNA）介导的DNA切割发挥作用；Cas12在切割靶向DNA后表现出非特异性单链DNA（ssDNA）反式切割活性；Cas13则靶向RNA并触发旁路RNA切割能力，这些特性为高特异性信号放大奠定了基础。

基于CRISPR/Cas的肿瘤生物标志物检测策略

肿瘤生物标志物包括核酸（如突变基因、microRNA）、蛋白质（如癌胚抗原）、细胞外囊泡（EVs）和循环肿瘤细胞（CTCs）。传统方法如聚合酶链反应（PCR）和酶联免疫吸附测定（ELISA）存在灵敏度有限、操作繁琐或多重检测能力不足的缺陷。CRISPR/Cas系统通过与重组酶聚合酶扩增（RPA）、环介导等温扩增（LAMP）等技术结合，实现了对低丰度生物标志物的超灵敏检测。例如：

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  Cas12a平台通过RPA预扩增与反式切割活性协同，可检测到₁₀^?18 M级别的核酸标志物；

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  Cas13a系统通过设计特异性gRNA与等温扩增联用，可实现单分子级别RNA标志物（如肿瘤相关miRNA）的定量；

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  针对蛋白质标志物，通过适配体-CRISPR耦合系统（如Cas12a与抗体-寡核苷酸缀合探针结合）将蛋白信号转化为核酸信号，灵敏度较ELISA提升百倍。

多重肿瘤生物标志物检测策略

通过组合不同CRISPR/Cas系统（如Cas12a+Cas13a）或设计多通道gRNA阵列，可实现多靶标同步检测。例如：

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  空间编码的微流控芯片集成Cas12与Cas13系统，同步检测肺癌相关基因突变（如EGFR^L858R）和肿瘤microRNA（如miR-21）；

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  电化学传感平台通过多组gRNA调控信号探针切割，实现CTCs表面蛋白（EpCAM）与细胞内核酸的双参数分析。此类策略显著提升了肿瘤分型与疗效监测的精准度。

挑战与展望

当前CRISPR/Cas检测技术仍面临临床转化挑战：

1. 1.

   复杂样本（如血液）中抑制剂对Cas活性的干扰需通过样本预处理或Cas蛋白工程改造优化；

2. 2.

   多重检测的通量扩展性与定量标准化需进一步验证；

3. 3.

   便携式设备开发与成本控制是基层应用的关键。未来方向包括开发常温稳定的Cas变体、深度学习辅助的多靶标设计算法，以及与微流控、纳米材料技术的深度融合，最终推动肿瘤液态活检的普及化与个性化。