综述：利用DNA修复机制在基因工程生物防治中的应用

本综述系统探讨了DNA修复途径（HDR、NHEJ、MMEJ、SSA）在基因驱动技术中的关键作用，指出当前研究多聚焦于HDR和NHEJ而忽视了MMEJ的潜力。作者强调需开发新型预测分析工具（如inDelphi、CRISPResso2）精准识别MMEJ介导的缺失突变，通过调控Polθ依赖性修复通路可优化基因编辑效率，为害虫防控提供新策略。

　　

基因生物防治与DNA修复通路

基因生物控制通过改变生物体的可遗传性状来降低特定物种的繁殖率或害虫潜力。策略包括利用天然共生体引发遗传效应、使用辐射或激素诱导不育，以及通过基因工程转基因产生不育或行为改变。基因驱动技术尤其受到关注，因其能以前所未有的速度和精度实现种群控制。最成熟的基因驱动方法利用CRISPR-Cas等可编程核酸酶在目标染色体上产生双链断裂（DSB），随后依赖内源性DNA修复机制进行修复。若通过同源定向修复（HDR）实现，则能成功推动基因驱动（等位基因频率增加）。但DSB也可通过竞争性修复通路处理，包括非同源末端连接（NHEJ）、微同源介导末端连接（MMEJ）和单链退火（SSA），这些通路可能导致靶位点产生插入缺失突变（indel），降低基因驱动转基因的效率并可能产生抗性等位基因。

近期在埃及伊蚊和果蝇中的研究开发了利用SSA诱变能力移除转基因的方法，其中两个直接重复序列之间的重组可移除所有间隔序列。与基于HDR的基因驱动类似，基于SSA的转基因移除与基于末端连接的修复存在竞争，后者可能降低该方法的有效性。因此，影响同源修复（HDR、SSA）与末端连接之间选择的因素需要更多关注，这些因素可用于改进基因生物防治。特别是了解竞争的末端连接DNA修复类型对于最小化其发生至关重要。

预测和检测CRISPR基因组编辑中的MMEJ

在植物、斑马鱼和人类中的先前工作表明，MMEJ是真核生物中保守的DNA修复通路，产生可预测的indel突变，对反向遗传学研究、临床基因治疗和更一般的位点定向基因编辑具有重要意义。尽管MMEJ编辑在这些基因编辑背景下有用，但如上所述，它常被忽视或误认为是更广泛研究的NHEJ修复通路，特别是在载体基因工程领域，因为两者都能产生indel突变。延续这一知识鸿沟的一个主要障碍可能是对哺乳动物基因组工程师开发和使用的更新的基因编辑分析工具缺乏认识和关注，这些工具预测并随后检测MMEJ。

MMEJ事件的分析可以（1）先验地使用MMEJ预测软件进行靶位点/sgRNA选择，或（2）事后识别indel和MMEJ归因事件。先验预测MMEJ事件有助于考虑DSB位点周围的局部微同源性，这些微同源性可能导致MMEJ indel。其分析可以简单到将目标DNA序列粘贴到在线MMEJ预测器网络应用程序中。其中一个工具是inDelphi，一个机器学习模型，使用来自五个人类和小鼠细胞系（HCT116、HEK293、K562、U2OS和mESC）的CRISPR编辑数据训练，涵盖超过2,000个靶位点，以预测各种MMEJ结果的频率。ForeCasT使用在超过2,000个靶序列的mESC编辑数据上训练的算法预测MMEJ事件，并在提供目标序列作为fasta文件时考虑多达18种不同DNA修复基因敲除对Cas9、碱基编辑或引物编辑结果的影响。此外，MENdel是一个命令行MMEJ预测算法，使用斑马鱼（体内）和HeLa细胞（体外）的基因编辑数据训练，结合了两个先前MMEJ预测工具MENTHU和Lindel的数据，为特定DNA序列的CRISPR/Cas和TALENs编辑提供预测信息。通过在sgRNA设计过程中应用这些算法，可能会增加实现理想基因编辑的可能性，例如具有高框外MMEJ潜力的靶位点，或者相反，具有很少微同源性因此indel形成概率较低的靶位点，例如旨在减少抗性等位基因的基因驱动靶位点。尽管有前景，我们注意到所有这些工具都是在脊椎动物细胞中的修复结果上训练的，其对无脊椎动物系统的效用仍有待确定。

MMEJ编辑也可以在事后分析，即在CRISPR处理、基因组DNA分离和通过PCR扩增编辑等位基因之后。事后分析在很大程度上取决于测序技术的适当选择，因为每种技术根据样品类型和扩增子大小提供不同的优势和限制。对于分析短读长（<1000 bp）、低通量样品，例如来自单个纯合生物的样品，Sanger测序提供了可靠的方法来分析每个个体的MMEJ编辑，尽管对数百个后代进行基因分型是劳动和时间密集型的。另一方面，更复杂的样品，包含混合的不同编辑等位基因，例如CRISPR编辑的细胞培养物或CRISPR注射的胚胎，其中数千个细胞可能含有不同的编辑事件，需要高通量测序方法，如Illumina或Oxford Nanopore（ONT）。Illumina测序提供高精度和通量，但成本较高且周转时间较长，而ONT测序提供长读长（>500 bp），成本较低，周转快。将ONT与来自CRISPR注射胚胎的扩增子结合应用，例如，可以在低成本和快速周转的情况下提供规模和分辨率，允许以Sanger等低通量方法不可能的方式测量不同Cas9/sgRNA组合的编辑效率。

从测序数据中检测MMEJ事件依赖于高保真度读段比对以进行正确的变异调用和indel识别。对于比对高通量原始测序数据，BWA和Bowtie2等软件包提供Illumina测序短读段的快速准确比对，而Minimap2提供有效可靠的方法来比对长测序读段，如ONT读段。对于事后分析Sanger测序数据以检测MMEJ事件，TIDE和ICE等在线网络应用工具提供免费、用户友好的界面，能够在提供色谱图和sgRNA靶位点时识别MMEJ事件。对于从CRISPR处理样品的高通量测序中检测基因编辑，CRISPResso2能够分析CRISPR编辑的序列，并提供indel直方图，详细说明每个插入和缺失的频率，以及等位基因频率表，详细说明每个编辑等位基因在所有分析读段中的频率，允许等位基因特异性分辨率以使用前述预测工具识别MMEJ事件和微同源性。此外，最近将ONT数据与CRISPResso2配对的报告显示，在Cas9/sgRNA编辑率和indel频率方面与Illumina数据和其他indel调用软件包相比具有可比结果，为分析不适合Illumina测序的长扩增子提供了可行替代方案。将等位基因频率表中的编辑等位基因序列与inDelphi、MENdel和ForeCasT等MMEJ检测软件配对，有助于识别和量化MMEJ介导的编辑及其相关微同源性。

总结与结论/展望

进一步了解DNA编辑过程可以扩展我们的基因编辑工具包并激发新的遗传载体控制解决方案。由于DNA修复过程在优化和开发新的遗传控制技术中扮演如此重要的角色，我们如何考虑和检测它们的工具包也应该如此。尽管先前认为主要是HDR和NHEJ修复过程之间的竞争，但我们强调未被充分研究的MMEJ修复机制也可能极大地影响害虫节肢动物中CRISPR处理后的DNA编辑。重要的是，我们注意到虽然NHEJ能够完美修复DSB，但MMEJ修复不能，并且其对DSB位点微同源性的要求可以通过避免或选择存在微同源性的靶位点来调节通过此DNA修复结果产生的indel频率。我们概述了可以帮助先验预测MMEJ和检测微同源性的工具，如inDelphi、ForCasT和MENdel，以及可以提供更高分辨率indel检测数据的工具，如CRISPResso2、TIDE和ICE。此外，我们注意到由于MMEJ修复是Polθ依赖性且独立于NHEJ因子，应该可以通过遗传拮抗此修复通路（通过CRISPR或RNAi）来减少MMEJ特异性修复结果，方式类似于NHEJ，因为Polθ在蚊子中是保守的。我们建议考虑和应用较少知的DNA修复结果进行基因编辑，如SSA和MMEJ，可能使通过CRISPR/Cas实现的理想基因编辑结果更易达到。