综述：直接RNA修饰作图：技术进步、差距与新兴趋势

本综述系统评述了直接RNA测序技术（包括LC-MS/MS与纳米孔测序）在RNA修饰分析中的应用与挑战。重点探讨了质谱技术（自上而下/自下而上MS）对短链治疗性RNA（如siRNA、ASO）的精准定位优势，以及纳米孔测序在长链RNA（如mRNA）修饰检测中的高通量潜力。同时指出酶工具短缺、算法训练成本高、序列覆盖度有限等共性瓶颈，为RNA治疗（如CRISPR、mRNA疫苗）的质量控制与疾病研究（癌症、神经疾病）提供关键技术支撑。

　　

LC-MS/MS：RNA修饰分析的黄金标准

液质联用技术（LC-MS/MS）通过液相色谱分离与质谱检测的协同作用，成为RNA修饰鉴定与表征的核心技术。其对短链治疗性RNA（如反义寡核苷酸ASO、小干扰RNA siRNA）的序列覆盖度、修饰定位精确度和定量可靠性已建立行业标杆。自上而下质谱（Top-down MS）可直接测序长度约35个核苷酸（nt）以内的寡核苷酸，而更长的RNA分子则需依赖自下而上策略（Bottom-up MS）——即通过核糖核酸酶（RNase）消化产生短片段后再进行LC-MS/MS分析。

色谱分离技术历经演变：早期离子对反相色谱（IPRP）专注于寡核苷酸梯度的分离，奠定了理论基础与实践标准；而亲水相互作用色谱（HILIC）自2019年起被广泛探索，其无需离子对试剂即可与质谱联用，且与IPRP具有正交性，显著提升了复杂混合物的分离能力。二维液相色谱（2D-LC）进一步应用于治疗性RNA分析，成功解析共洗脱杂质并通过非质谱兼容模式分离目标峰。

质谱碎裂技术的研究聚焦于多模式互补策略：碰撞诱导解离（CID）与电子转移解离（ETD）的组合应用最为广泛，紫外光解离（UVPD）等新兴技术则为难解样本提供了额外序列覆盖度。然而，随着RNA长度增加，RNase T1酶切产生的冗余产物会降低序列覆盖效率。近期商业化推出的高特异性尿苷（U）与胞苷（C）切割酶有望缓解该问题，但酶工具库的整体匮乏仍是行业瓶颈。

技术革新体现在流程自动化：固定化RNase酶柱与多维液相色谱-质谱（MD-LC-MS）平台的在线整合，实现了5分钟内完成酶切反应，大幅降低样本量需求、提升通量并减少人工操作引入的误差。尽管如此，不完全酶切产物的存在仍使数据处理复杂化，难以扩展至非靶向分析领域。

纳米孔测序：长读长RNA修饰检测的新兴力量

纳米孔测序技术诞生于1990年代，其通过监测核酸分子穿过蛋白质纳米孔时引起的电流变化实现单分子测序。区别于依赖cDNA转换的间接测序方法（如Illumina NGS），直接RNA测序可保留原始修饰信息，支持长达26 kb的RNA分子全程分析，并能同步检测多种修饰类型，提供全局性修饰图谱。

该技术的核心挑战在于信号解码：原始电流信号需通过机器学习驱动的碱基识别器（basecaller）转化为核苷酸序列。开发高精度碱基识别器需大规模RNA标准品训练——仅未修饰RNA即需至少1,024条独特序列以覆盖所有五核苷酸组合。尽管算法持续优化（如Guppy基调用器使未修饰RNA准确率从2018年的85–90%提升至2024年的95%以上），但不同工具在灵敏度、精确度与偏差方面仍存在差异。

当前纳米孔测序主要应用于多聚腺苷酸尾（polyA-tailed）的转录组分析，对短链RNA（<100 nt）的检测仍受限（因易穿孔过快且电机蛋白结合效率低）。其可识别修饰类型虽暂不及质谱广泛（主要限于碱基修饰），但已成功检测到N6-甲基腺苷（m⁶A）、假尿苷（Ψ）、肌苷、5-甲基胞苷（m⁵C）及2′-O-甲基化（2′-OMe）等关键修饰。值得注意的是，纳米孔技术的研发高度依赖牛津纳米孔公司（ONT），因算法训练与专用硬件开发成本高昂，限制了学术界的独立探索。

结论与未来展望

RNA修饰作图技术正面临学术、工业与公共机构的协同推进。LC-MS/MS在短链治疗性RNA分析中保持金标准地位，而纳米孔测序在长链RNA修饰检测中展现独特优势。两者短板亦鲜明：质谱技术随RNA长度增加而效能下降，纳米孔则受限于碱基识别精度与修饰类型覆盖范围。

未来突破需聚焦三方面：其一，开发更高效特异的RN酶工具库以提升序列覆盖率；其二，通过算法优化与计算平台升级降低纳米孔数据解析门槛；其三，探索多技术联用方案（如质谱验证纳米孔推测修饰），共同推动RNA治疗产品质量控制与疾病机制研究的深度发展。