高保真AaCas12bMax增强工程化T细胞疗法的安全性与功能适应性

本研究针对CRISPR-Cas9系统存在的脱靶效应和染色体不稳定性问题，开发了工程化AaCas12bMAX基因编辑平台。通过系统性比较发现，该平台在TIL疗法中实现了>80%的靶向效率，脱靶事件不可检测，并将结构变异降低3.3倍，显著提升T细胞扩增能力和抗肿瘤功能，为下一代T细胞治疗提供更安全有效的技术方案。

　　

随着CRISPR-Cas系统在基因编辑领域的革命性进展，基于化脓链球菌Cas9（SpCas9）的基因编辑技术已广泛应用于生物医学研究。然而，该技术存在的脱靶效应和染色体不稳定性问题严重限制了其在临床治疗中的应用，特别是在需要高度精准性的工程化T细胞治疗领域。肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor Infiltrating Lymphocyte, TIL）疗法作为过继性细胞治疗的重要分支，其疗效与基因编辑的精确性和安全性密切相关。如何突破现有技术的局限性，开发具有更高精准度和安全性的基因编辑平台，成为推动下一代T细胞治疗发展的关键挑战。

在这项发表于《Molecular Therapy》的研究中，来自Grit Biotechnology的研究团队对源自嗜酸脂环芽孢杆菌（Alicyclobacillus acidiphilus）的Cas12b变体进行工程化改造，开发出高保真编辑工具AaCas12b^MAX，并系统评估了其在TIL治疗中的应用潜力。研究人员采用符合FDA规范的安全评估框架，从靶向效率、全基因组脱靶活性和结构变异（Structural Variants, SVs）形成等多个维度，对比了AaCas12b^MAX与SpCas9编辑的TIL产品。

研究采用的主要技术方法包括：基于FDA合规标准的安全性评估体系、全基因组脱靶分析技术、结构变异检测方法、DNA损伤响应监测系统、分子动力学模拟分析，以及T细胞功能评估体系（包括扩增能力检测和细胞亚群表型分析）。所有TIL样本均来源于临床肿瘤患者。

研究结果

靶向编辑效率与安全性特征

研究人员发现AaCas12b^MAX在TIL中实现了超过80%的靶向编辑效率，且在全基因组范围内未检测到脱靶事件。与SpCas9相比，AaCas12b^MAX编辑的细胞中结构变异减少3.3倍，表现出显著的安全性优势。

DNA修复动力学机制

机制研究表明，AaCas12b^MAX编辑的细胞表现出不同的DNA修复动力学特征，减少了持续的DNA损伤响应和染色体不稳定性。这种差异化的修复机制可能是其安全性提升的重要原因。

结构基础与分子机制

通过结构建模分析发现，AaCas12b^MAX能够形成更稳定的酶-sgRNA-DNA三元复合物，这种结构稳定性使其具有更严格的PAM（Protospacer Adjacent Motif）特异性和最小的错配容忍度，从分子层面解释了其高精准性的结构基础。

功能性评估

在功能层面，AaCas12b^MAX编辑的TIL表现出卓越的治疗潜力：细胞适应性增强、扩增能力提高两倍，并且显著富集了具有干细胞样特性的肿瘤反应性CD39^-CD69^-CD8⁺ T细胞亚群。这些功能优势表明该平台不仅提高了安全性，还增强了T细胞的抗肿瘤功能。

研究结论表明，AaCas12b^MAX作为一个稳健的、可临床转化的基因编辑平台，成功克服了SpCas9在安全性和功能性方面的局限。该平台通过独特的DNA修复动力学特性和稳定的三元复合物结构，实现了高精准性的基因编辑，同时保持了T细胞的最佳功能状态。这些发现不仅为下一代T细胞治疗产品的开发提供了技术基础，也为基于CRISPR的基因治疗安全性评估建立了新的标准。该研究的创新性在于将工程化酶改造、机制探索和功能性验证相结合，全面展示了AaCas12b^MAX在临床应用中的巨大潜力，为推进精准细胞治疗的发展提供了重要技术支持。