原发性人类T细胞中遗传和表观遗传筛选揭示自身免疫病因果变异与T细胞网络的关联

本研究针对自身免疫病相关遗传变异如何通过调控CD4+ T细胞功能影响疾病风险这一核心问题，研究人员通过大规模平行报告基因分析(MPRA)和单细胞/批量CRISPR干扰筛选技术，在原发性人类T细胞中系统鉴定了545个等位基因特异性表达调控变异(emVars)，发现这些变异显著富集于精细定位的因果变异，并通过调控T细胞活化网络和MAPK信号通路等关键途径影响T细胞增殖与功能，为解析自身免疫病的分子机制和靶向治疗提供了重要依据。

　　

自身免疫性疾病如多发性硬化症、1型糖尿病、银屑病、类风湿性关节炎和炎症性肠病等，影响着全球数百万人的健康。全基因组关联研究(GWAS)已鉴定出数千个与这些疾病相关的遗传变异，但其中超过99%位于非编码区域，且与许多其他变异存在紧密连锁不平衡，导致真正的因果变异及其功能机制仍不明确。特别值得注意的是，这些自身免疫病相关变异在CD4⁺ T细胞的顺式调控元件中高度富集，提示它们可能通过改变基因调控来影响疾病风险。然而，由于T细胞基因调控的复杂性以及缺乏在疾病相关原代细胞中的高效功能筛选方法，很少有遗传变异被证实能够直接影响T细胞的基因表达或功能。

为了解决这一挑战，研究人员在《Nature Genetics》上发表了最新研究成果，通过在原发性人类CD4⁺ T细胞中开展大规模平行报告基因分析(MPRA)和CRISPR干扰(CRISPRi)筛选，系统鉴定出能够调控基因表达的自身免疫病相关变异，并深入解析了这些变异如何通过影响T细胞网络和信号通路来介导疾病风险。

研究团队首先构建了包含18,312个自身免疫病相关变异的MPRA文库，这些变异来自欧洲人群1000 Genomes Project中与5种主要自身免疫疾病相关的578个索引单核苷酸多态性(SNPs)及其连锁不平衡(R² > 0.8)变异。通过在激活的原代人类CD4⁺ T细胞中进行MPRA实验，研究人员发现了1,125个具有顺式调控活性的元件，其中545个表现出等位基因特异性表达调控作用(称为emVars)。这些原发性T细胞emVars在39.2%的测试位点中被发现，且在53.8%的位点中每个单倍型仅有一个emVar。

进一步分析表明，原发性T细胞emVars和推定的顺式调控元件在活性染色质标记和其他顺式调控活性读数中均显著富集，且主要位于原发性T细胞的可及染色质中。更重要的是，这些emVars在精细定位的因果变异中高度富集——在所有位点中，emVars对高后验概率变异的富集程度达到2-4倍；而在至少有一个emVar的位点中，emVars对后验包含概率(PIP) > 0.8的变异的富集程度高达71倍(PICS方法)和50倍(SuSiE方法)。当仅考虑T细胞DN酶超敏感位点(DHS)中的变异时，emVars对高后验概率变异的富集甚至达到122-200倍。这些结果表明，原发性T细胞MPRA能够以27%的敏感性和88%的特异性识别精细定位的95%可信集中的变异。

为了探究不同细胞环境中转录因子使用的差异，研究人员比较了原发性T细胞和Jurkat T细胞系中的MPRA结果。尽管两种细胞类型的emVars都高度富集因果变异，但仅有45个emVars在两个数据集中重叠，虽然这一数字仍显著高于随机预期。通过转录因子 motif 破坏分析和SCENIC单细胞基因调控网络分析，研究发现原发性T细胞emVars更可能影响与炎症相关的转录因子，如NFKB1、STAT3、JUN和FOSB等，而Jurkat细胞则更多由SOX4、ATF4和ELF2等转录因子驱动。此外，研究人员还发现了疾病特异性的转录因子效应，例如ZNF563 motif的破坏在类风湿性关节炎位点中具有激活作用，而在银屑病位点中则表现为抑制作用。

为了解emVars调控的通路和网络，研究人员通过Open Targets Variant to Gene (V2G)数据集和STRING网络分析，发现原发性T细胞emVars的推定靶基因在淋巴细胞活化、翻译、转录调控、抗原加工、mRNA加工和剪接等网络中显著富集。特别值得注意的是，淋巴细胞活化集群中包含了许多已知的T细胞共刺激基因，如CD28、CTLA4、ICOS、GITR、OX40和SLAM家族成员；而转录调控集群则包含多个NF-κB信号家族成员，如NFKB1、NFKB2、NFKBIA、TNFAIP3和TNIP。这些网络特征在Jurkat细胞emVars的对应分析中并未发现，表明原发性T细胞emVars更可能影响T细胞共刺激和NF-κB信号通路。

为了直接连接变异与其调控的靶基因，研究人员在原发性T细胞中进行了单细胞CRISPRi (scCRISPRi)筛选，针对56个emVar顺式调控元件设计了引导RNA (gRNAs)，并使用与染色质抑制结构域ZIM3-KRAB融合的催化失活Cas9 (dCas9)来靶向这些元件。通过单细胞RNA测序评估局部基因表达变化(within 1 Mb)，研究发现13个emVar元件至少影响一个邻近基因的表达，共鉴定出18个显著的emVar-基因相互作用。

其中，rs61839660 (1型糖尿病和IBD，PICS = 0.98)是IL2RA内含子变异，与IL2RA下调以及IL15RA和RBM17的上调相关；rs887314 (银屑病，PICS = 0.13)位于BAD启动子区域，调控BAD、GPR137和OTUB1表达；rs56095240 (多发性硬化症，PICS = 0.18)位于SESN3远端 intergenic 区域，调控SESN3表达；rs60600003 (多发性硬化症，PICS = 0.48)位于ELMO1内含子，显著影响ELMO1表达。此外，研究人员还发现rs1250567和rs7441808分别调控RBPJ和ZMIZ1，这两个基因都参与T细胞中的WNT信号通路；rs61907765 (银屑病，PICS = 0.43)与ETS1表达相关，该转录因子参与T细胞存活、激活和自然调节性T细胞的发育。

为了系统评估emVar顺式调控元件对T细胞功能的影响，研究人员进行了批量CRISPRi筛选，靶向约1,000个自身免疫病相关变异位点，并评估dCas9-ZIM3介导的沉默对T细胞增殖的影响。研究发现21个变异位点与T细胞增殖显著相关，其中包括已知的阳性对照VAV1和IL-2RB (正向调控增殖)以及CBLB (负向调控增殖)。在重点分析的56个emVar元件中，研究人员发现12个emVar元件在靶向后减少T细胞增殖，1个emVar元件促进增殖。

特别值得注意的是，rs10932019 (类风湿性关节炎，PICS = 0.007)、rs9610375 (多发性硬化症，PICS = 0.0028)和rs4802307/rs62136101 (IBD，PICS = 0.1和0.06)等emVar元件对增殖有显著影响。其中rs4802307和rs62136101位于PPP5C基因座，这两个变异与T细胞表达数量性状位点数据中PPP5C表达降低相关，且对IBD具有保护作用。通过单细胞筛选发现，PPP5C是这两个emVar元件的唯一显著差异表达基因。

进一步的功能研究表明，PPP5C在T细胞中是一个先前未被重视的信号调控因子，通过控制MAPK信号通路中多个关键成员的基线磷酸化水平来调节T细胞代谢和效应程序。PPP5C敲除增加了AKT、CREB、ERK1/2、GSK3A和JNK等多个MAPK信号通路组分的磷酸化水平，特别是在未刺激条件下；而PPP5C过表达则降低了这些信号组分在未刺激条件下的磷酸化水平。

本研究的主要技术方法包括：使用大规模平行报告基因分析(MPRA)在7例人原代CD4⁺ T细胞中测试18,312个变异的功能效应；通过单细胞CRISPR干扰(scCRISPRi)筛选在5例人原代T细胞中连接56个emVar元件与靶基因；采用批量CRISPRi增殖筛选在4例人原代T细胞中评估约1,000个变异对T细胞增殖的影响；结合蛋白质磷酸化阵列分析PPP5C对MAPK信号通路的调控机制。

研究结果表明，原发性人类T细胞中的MPRA能够有效识别可能因果的自身免疫病相关变异，这些变异通过影响炎症相关转录因子结合和T细胞活化网络来调控基因表达。scCRISPRi和增殖筛选进一步将变异与靶基因和T细胞功能直接连接，揭示了PPP5C等先前未重视的基因在T细胞信号调控中的重要作用。这些发现为理解自身免疫病的遗传机制提供了新视角，并为开发靶向治疗策略奠定了基础。

研究的讨论部分强调，识别复杂性状的因果变异并确定其在疾病相关细胞类型中的效应仍然是一个长期挑战。尽管Open Targets Genetics等在线数据库提供了重要的观察性和相关性数据，但每个单倍型通常仍存在多个可能因果变异和推定靶基因。将MPRA和CRISPRi等高通量扰动数据纳入这些数据库，将有助于更好地界定变异和单倍型活性背景。此外，在不同细胞类型和状态中测试相同的MPRA文库可能会发现更多影响顺式调控活性的变异，而使用替代剪接或转录本稳定性MPRA等技术将进一步扩展对变异功能的理解。

最后，研究人员指出，尽管scCRISPRi筛选发现了emVar靶基因，但这些结果与Open Targets Genetics数据的吻合度有限，提示变异或其单倍型的多效性效应可能取决于测试的细胞类型和状态。增强gRNA的数量和效能以及增加检测细胞数可能提高筛选的敏感性，而碱基编辑等更精确的方法将有助于最终确定变异机制。

总之，这项研究通过在原发性人类T细胞中的基因组筛选，将可能因果的自身免疫病相关变异与T细胞表达网络和功能联系起来，为提出由原发性T细胞介导的自身免疫病风险和保护机制提供了基础，并开始确定变异的聚合特性，这可能有助于多基因风险评分分层和个体化靶向治疗策略的开发。