工程化碱基编辑器实现最小化基因组错误：新型vPE系统显著提升基因编辑精准度

本研究针对Prime Editor（PE）在基因编辑过程中易产生插入/缺失（indel）错误的问题，通过Cas9切口酶突变松弛切口定位，促进竞争性5'链降解，开发出具有极低indel错误率的新一代编辑器vPE。该编辑器在保持高效编辑的同时，将indel错误降低60倍，编辑精度比达543:1，为精准基因治疗提供了重要工具。

　　

基因编辑技术CRISPR-Cas9的发展为精准治疗遗传疾病带来了革命性希望，但传统的碱基编辑器在操作过程中往往会产生意想不到的插入或缺失突变（indel），这些“脱靶”错误可能导致基因组不可预测的改变，甚至引发有害后果。虽然科研人员通过优化引导RNA（pegRNA）设计、改造逆转录酶结构域等策略提升了编辑效率，但indel错误仍然是制约其临床应用的瓶颈问题。

近日，由Vikash P. Chauhan、Phillip A. Sharp和Robert Langer共同完成的研究在《Nature》发表，他们通过理性设计Cas9切口酶（Cas9n）的突变体，开发出具有显著低基因组错误的新型Prime编辑器（PE），不仅编辑效率高，而且极大降低了indel突变率。

研究人员主要采用以下关键技术方法：首先通过高通量筛选鉴定出可松弛DNA切口定位的Cas9突变体；随后利用深度测序（deep sequencing）分析编辑结果和indel频率；结合流式细胞术（flow cytometry）在HEK293T、A549、HeLa细胞及小鼠胚胎干细胞（ESCs）中验证编辑效率与精度；并通过CRISPResso2软件进行数据分析。

松弛切口定位可降低错误率

通过筛选14种Cas9丙氨酸替代突变体，研究团队发现R780A、K810A等突变能促使非目标链5'端发生降解。利用双gRNA切割基因组的实验体系，他们发现这些突变体可使切口偏移频率显著增加，同时PAM侧末端降解程度加深。将这类突变引入PE编辑器后，其编辑窗口发生松弛，负位点编辑效率提升，而indel错误率大幅降低。

组合突变实现高效低错编辑

研究人员将R221K、N1317R等已知可提升Cas9活性的突变与切口松弛突变组合，构建出xPE编辑器。在六种基因位点（CXCR4、EMX1等）的测试中，xPE在pegRNA单独编辑模式下将indel错误降低5倍，在pegRNA+ngRNA模式下更降低12.7倍，最高编辑精度比达到199:1。

RNA保护进一步增强性能

针对松弛切口编辑器可能加剧pegRNA不稳定的问题，团队将xPE中的Cas9n与PE7架构中的La蛋白（可结合poly-U稳定RNA）融合，开发出very-precise prime editor（vPE）。实验表明，vPE在多种细胞系和编辑类型中均表现出更高编辑效率和更低错误率，其编辑精度比可达465:1，且能有效抑制大片段缺失、插入等错误类型。

广泛应用潜力与低脱靶效应

vPE在多种人类细胞系和小鼠胚胎干细胞中均表现出优异的编辑性能，成功将GFP转换为BFP而几乎无indel错误。此外，vPE在已知脱靶位点上的编辑效率显著低于PE7，说明其具有更好的特异性。对于大片段替换、插入及缺失编辑，vPE同样能维持高精度。

研究结论与讨论

该研究通过系统性地改造Cas9切口酶的DNA结合界面，开发出具有极小基因组错误的prime编辑器vPE。其核心机制是通过突变松弛切口定位，促进竞争性5'链降解，从而减少indel错误形成。vPE在多种编辑模式、细胞类型和靶位点中均表现出稳定和高精度的编辑能力，不仅解决了prime编辑中错误不可预测的问题，而且无需额外调控细胞状态或DNA修复途径。

这项研究为基因组精准编辑提供了新一代工具，极大提高了基因治疗的安全性，对未来临床应用具有重大意义。研究者还提出，通过调控DNA底物稳定性以增强编辑精度可能成为基因组编辑器设计的新范式。