大豆快速碱化因子GmRALFs在植物免疫中的功能解析：GmRALF1作为易感基因的鉴定与机制研究

本研究针对大豆病害防控需求，系统解析了快速碱化因子RALF肽家族在植物免疫中的作用机制。通过功能筛选发现GmRALF1能显著抑制模式触发免疫（PTI）及对细菌、真菌和卵菌的抗性，CRISPR敲除实验证实GmRALF1缺失可增强大豆对Pseudomonas syringae和Phytophthora sojae的抗性，为大豆抗病育种提供了新靶点。

　　

大豆作为全球重要的油料作物和植物蛋白来源，其生产常受到真菌、细菌和卵菌等病原微生物的威胁，导致严重产量损失。传统化学防治方法面临环境压力和病原抗性增加的挑战，因此挖掘植物自身免疫机制、培育广谱抗病品种成为可持续农业的重要方向。植物免疫系统依赖细胞表面的模式识别受体（PRRs）识别病原体相关分子模式（PAMPs），激活模式触发免疫（PTI），从而提供基础抗性。然而，病原体常分泌效应子抑制PTI，植物则通过细胞内NLR受体激活效应子触发免疫（ETI）进行反击。近年来，一类被称为快速碱化因子（RALF）的小分泌肽在植物生长发育和逆境响应中崭露头角，但其在大豆免疫中的功能尚不明确。

为系统解析大豆RALF家族的功能，研究人员对大豆基因组中的24个GmRALF成员进行了全面分析。通过进化树和基序分析发现，这些GmRALFs具有保守的YISY motif和半胱氨酸残基，但基因结构和染色体分布呈现多样性，暗示功能分化。表达谱分析显示，不同GmRALFs在根、茎、叶、花等组织中表达具有特异性，且多数成员在病原菌（Pseudomonas syringae pv. glycinea和Phytophthora sojae）侵染后表达显著变化，表明它们可能参与免疫调控。

为了高效筛选免疫相关GmRALFs，研究团队采用烟草瞬时表达系统，通过农杆菌介导的基因递送，在本氏烟叶片中表达单个GmRALF，并检测其对三种典型PAMP（细菌flg22、真菌几丁质和卵菌INF1）诱导的免疫反应的影响。结果显示，多数GmRALFs正调控flg22诱导的活性氧（ROS）爆发，但GmRALF1和GmRALF18却显著抑制flg22、几丁质和INF1触发的PTI反应。进一步病原接种实验表明，过表达GmRALF1或GmRALF18的本氏烟对细菌（Pseudomonas syringae pv. tomato ΔhopQ1）、真菌（Sclerotinia sclerotiorum）和卵菌（Phytophthora capsici）更敏感，而GmRALF2、6、8、10和20则增强广谱抗性。

研究团队重点关注了抑制效应最强的GmRALF1。通过生物信息学分析，发现其在本氏烟中的同源基因NbRALF1同样负调控免疫：病毒诱导的基因沉默（VIGS）敲低NbRALF1后，flg22诱导的ROS爆发、MAPK激活和防御基因表达均显著增强，植株对病原菌抗性也明显提升。为验证GmRALF1在大豆中的功能，研究人员利用CRISPR-Cas9技术构建了Gmralf1突变体。表型分析发现，突变体中flg22诱导的ROS爆发和防御基因（GmPR1、GmGCN5）表达显著增强，对Psg和P. sojae的抗性也明显提高，且植株生长发育未受严重影响，表明GmRALF1是一个潜在的抗病育种靶点。

本研究综合运用了多种关键技术方法：通过生物信息学对GmRALF家族进行系统鉴定和进化分析；采用qPCR技术检测基因表达响应；利用农杆菌介导的瞬时表达技术在烟草中进行高通量功能筛选；通过病毒诱导基因沉默（VIGS）和CRISPR-Cas9基因编辑进行功能验证；使用病原接种试验（包括细菌计数、病斑面积测量）评估抗性表型。

研究结果

GmRALFs在病原侵染下的表达模式

通过qPCR分析发现，大豆幼苗在P. sojae和Psg侵染后，多数GmRALFs转录水平显著上调或下调，其中GmRALF1和GmRALF4在两种病原处理中均下调，提示其可能负调控免疫。

GmRALFs调控PTI反应的功能多样性

瞬时表达实验表明，GmRALF1和GmRALF18显著抑制flg22和几丁质诱导的ROS爆发以及INF1引起的细胞死亡，而GmRALF8和GmRALF10等正调控ROS产生。

GmRALFs影响多种病原抗性

病原接种试验显示，过表达GmRALF1或GmRALF18显著增加本氏烟对细菌、真菌和卵菌的敏感性，而GmRALF6、8、10、20和24增强广谱抗性。

NbRALF1同源基因的功能保守性

本氏烟中GmRALF1同源基因NbRALF1同样负调控免疫：沉默该基因后，PTI反应增强，植株对Pst DC3000 ΔhopQ1和P. capsici抗性提升。

GmRALF1突变体验证其免疫负调控功能

CRISPR-Cas9获得的Gmralf1突变体在PTI反应和病原抗性方面均显著增强，且生长发育未受严重影响，证实GmRALF1是一个负调控免疫的易感基因。

讨论与结论

本研究首次在大豆中系统揭示了RALF肽家族在免疫调控中的功能分工：多数GmRALFs正调控PTI和病原抗性，但GmRALF1和GmRALF1却作为负调控因子抑制免疫反应。GmRALF1的同源基因在本氏烟中功能保守，且基因敲除后显著增强大豆对细菌和卵菌的抗性，表明其是一个在抗病育种中具有应用潜力的易感基因。与拟南芥中RALF23通过FERONIA受体抑制免疫的机制不同，GmRALF1可能通过未知受体复合物干扰PTI信号通路，这为后续解析其作用机制提供了方向。此外，GmRALF1在花器官中高表达，暗示其可能兼有调控生殖发育的功能，需进一步研究其多功能性。该研究成果不仅深化了对植物免疫调控网络的理解，也为大豆抗病品种的分子设计育种提供了新策略。论文发表于《Phytopathology Research》，为作物免疫学研究提供了重要理论依据和应用参考。