SETD2甲基转移酶调控铁代谢新机制：揭示肿瘤铁死亡抵抗与免疫逃逸的遗传基础

本刊推荐：细胞铁水平需精密调控以维持稳态，但铁代谢的遗传调控网络尚不明确。研究人员通过全基因组CRISPR-Cas9筛选，绘制了铁代谢的遗传图谱，发现组蛋白甲基转移酶SETD2通过调控铁蛋白自噬（ferritinophagy）影响铁通量。SETD2缺失导致细胞内铁缺乏，进而诱发铁死亡（ferroptosis）抵抗，这为SETD2突变肿瘤的免疫逃逸机制提供了新解释。

　　

细胞内的铁水平必须被精确调控：既要保证足够的铁参与生命必需的酶促反应，又要避免产生有害的活性氧物种。尽管铁代谢的核心调控机制——如铁调节蛋白（IRP1和IRP2）通过结合铁响应元件（IRE）介导的转录后调控——已被初步阐明，但细胞内游离铁池（labile iron pool, LIP）的动态调控、铁在亚细胞器间的 trafficking 机制，以及细胞核在铁稳态中的作用，仍存在大量未知。尤其近年来发现，铁还参与一种新型细胞死亡形式——铁死亡（ferroptosis），这使其在肿瘤治疗与免疫调控中的意义日益凸显。

为了系统揭示铁代谢的遗传调控网络，研究人员开展了这项研究。他们首先巧妙地构建了能够灵敏反映细胞内铁水平的报告基因系统：通过CRISPR-Cas9基因编辑技术，将荧光蛋白Clover标签内源性敲入到铁核心感应蛋白IRP2的C端，创建了IRP2-Clover报告细胞系（HeLa和A549）。由于IRP2的稳定性与细胞内铁水平成反比，该报告细胞的荧光强度可动态、定量地指示铁通量的变化。

利用这一强大工具，研究团队在两种细胞系中分别进行了全基因组规模的CRISPR-Cas9敲除筛选，通过富集IRP2-Clover^HIGH的细胞（即铁缺乏表型），系统鉴定了正负调控铁稳态的关键基因。筛选结果不仅验证了已知的铁代谢核心通路（如转铁蛋白受体TfR的内吞回收、v-ATPase介导的铁还原、线粒体铁代谢和铁蛋白自噬），还发现了一批新的调控因子，其中包括了多个此前未知的细胞核定位基因，最引人注目的是组蛋白H3K36三甲基化（H3K36me3）甲基转移酶SETD2。

SETD2的缺失或其催化活性被抑制剂EZM0414抑制后，均导致IRP2蛋白积累，且该表型可被外源铁补充所逆转，表明SETD2功能缺失造成了细胞的功能性铁缺乏。机制探索表明，SETD2并非通过调控经典的TfR内吞或mTORC1通路起作用，而是影响了铁蛋白自噬过程。SETD2缺失细胞中，铁蛋白自噬的货物受体NCOA4蛋白异常积累，而铁蛋白重链（FTH1）的降解受阻，表明 ferritinophagy 流程存在缺陷。进一步的证据显示，SETD2缺失导致全基因组范围的剪接异常，与铁代谢相关的多个基因（如NCOA4、MFRN1和TFRC）发生了差异剪接，这可能是其破坏铁稳态的重要机制。

研究的最后部分将基础发现与疾病机制巧妙连接。鉴于SETD2是肾透明细胞癌（ccRCC）等肿瘤中的高频突变基因，研究人员测试了SETD2缺失对铁死亡敏感性的影响。结果发现，SETD2缺失的癌细胞（如A498和经敲低的786-O细胞）对铁死亡诱导剂erastin的抵抗性显著增强，脂质过氧化水平降低。更重要的是，SETD2缺陷的肺癌细胞（H838）对自然杀伤（NK）细胞介导的杀伤作用也变得不敏感，这为SETD2突变肿瘤如何逃避免疫监视提供了一个全新的解释：通过扰乱铁代谢-铁死亡轴来实现。

本研究发表于《SCIENCE ADVANCES》，为了完成这项研究，作者运用了几个关键核心技术：1） 利用CRISPR-Cas9同源重组构建内源性荧光报告细胞系（IRP2-Clover）；2） 在A549和HeLa细胞中进行全基因组CRISPR-Cas9敲除筛选（使用Whitehead和TKOv3文库），并通过流式分选富集表型细胞；3） 使用shRNA/siRNA进行基因敲低验证；4） 利用蛋白质免疫印迹、流式细胞术、亚细胞组分分离和免疫荧光进行表型与机制分析；5） 对公共数据集（ChIP-seq和RNA-seq）进行生物信息学再分析，研究SETD2缺失对剪接和基因表达的影响；6） 通过电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）测定细胞铁含量；7） 使用erastin诱导和BODIPY-C11染色检测铁死亡和脂质过氧化；8） 利用健康 donor 来源的原代扩增人NK细胞进行体外细胞毒性实验。

IRP2-Clover reporter cells provide a sensitive and dynamic readout for intracellular iron levels

研究人员首先证实了内源标记的IRP2-Clover报告系统能准确、动态地响应细胞内铁水平的变化。铁螯合剂DFO或v-ATPase抑制剂BafA处理可导致IRP2-Clover积累，而外源铁（FAC）可逆转此效应。遗传敲低TFRC或NCOA4同样引起报告分子升高，验证了该系统可用于监测铁摄取与回收途径的功能状态。

Genome-wide mutagenesis screens define the key regulators of intracellular iron metabolism

全基因组筛选成功鉴定出已知的铁代谢核心基因（如FBXL5、TFRC），并发现了一系列新的调控因子。基因功能聚类将命中基因归入TfR内吞回收、v-ATPase功能、线粒体铁硫簇（Fe-S）组装、 ferritinophagy 以及囊泡运输（如外泌体复合体）等通路。值得注意的是，筛选发现了四个核定位基因，其中包括SETD2。

The exocyst complex and mitochondrial iron metabolism influence cellular iron flux

验证实验发现，外泌体复合体亚基EXOC1的缺失会损害TfR的回收过程，导致细胞内Tf滞留和IRP2积累。另一方面，线粒体铁伴侣HSCB或铁输入蛋白MFRN1的缺失也会引起IRP2-Clover上调，表明线粒体铁利用障碍会向胞质传递“铁缺乏”信号，并触发补偿性反应。

Loss of the histone methylase SETD2 results in an iron-dependent IRP2 response

SETD2的缺失（通过sgRNA/shRNA或药理学抑制）在不同细胞系中均引起IRP2积累，且该效应依赖于其甲基转移酶活性（伴随H3K36me3水平下降）。细胞分馏和免疫荧光证实SETD2主要定位于细胞核，排除了其通过非经典功能（如微管甲基化）起作用的可能性。

SETD2 deficiency results in defective ferritinophagy

机制研究表明，SETD2缺失并不影响TfR的表达或内吞循环，但导致铁蛋白自噬受体NCOA4的蛋白水平显著积累，而铁蛋白降解受阻。CHX追踪实验和与ATG9A等自噬基因缺陷细胞的对比实验表明，SETD2缺失特异性地损害了 ferritinophagy 过程。对公共测序数据的分析显示，SETD2缺失导致全基因组剪接错误，NCOA4等铁代谢基因的mRNA剪接受到了显著影响，这可能是其功能紊乱的主要原因。

Loss of SETD2 drives resistance to ferroptosis in cancer cells

功能上，SETD2缺失的肾癌细胞（A498和786-O敲低）和肺癌细胞（A549敲低）对erastin诱导的铁死亡表现出显著抵抗，脂质过氧化水平降低。更重要的是，SETD2缺陷的肺癌细胞（H838）在体外对原代人NK细胞介导的杀伤作用敏感性下降，这表明SETD2突变可能通过导致铁死亡抵抗，帮助肿瘤细胞逃避免疫攻击。

归纳研究结论与讨论，本研究通过创新的遗传筛选策略，首次绘制了人类细胞铁代谢的全局性遗传图谱，揭示了铁摄取、回收、储存和线粒体利用等通路的相对贡献及其核心调控因子。其最突出的发现是确立了组蛋白甲基转移酶SETD2作为铁稳态的一个新型表观遗传调控因子。SETD2主要通过维持正常的mRNA剪接 fidelity，确保铁蛋白自噬（ferritinophagy）的正常进行。当其功能丧失时，会导致细胞内铁释放受阻，引发功能性铁缺乏和IRP2稳定化。这一发现挑战了铁代谢主要受转录后调控的传统观点。更重要的是，该研究将SETD2基因突变与肿瘤细胞的铁死亡抵抗和NK细胞免疫逃逸联系起来，为理解SETD2突变肿瘤的生物学行为提供了全新的机制视角，也为针对铁死亡途径的癌症治疗策略提供了重要的理论依据和潜在的生物标志物。