AsCas12a独特耐受DNA插入能力揭示CRISPR-Cas系统新机制并推动精准诊断技术发展

本研究针对CRISPR-Cas12a系统对靶DNA严格互补依赖的局限性，发现AsCas12a可耐受1-20 nt的DNA插入并保持cis/trans切割活性。该特性源于其WED域独特α-helix结构，实现了PAM-flexible切割和单核苷酸多态性（SNP）精准检测，为基因组编辑和分子诊断提供了新策略。

　　

CRISPR-Cas系统作为革命性的基因组编辑工具，其效能高度依赖向导RNA（crRNA）与靶DNA的完全互补配对。传统观点认为，即使单个碱基错配也会显著降低Cas12a酶的切割活性，这严重限制了其在复杂遗传变异检测中的应用。然而，本研究意外发现来自Acidaminococcus sp.的Cas12a（AsCas12a）竟能耐受靶DNA中长达20个核苷酸的插入，并保持顺式（cis）和反式（trans）切割活性，这一特性在12种Cas12a直系同源物中唯AsCas12a所独有。

为深入解析这一现象，研究团队综合运用了多种关键技术：通过荧光反式切割实验系统评估了不同长度（1-20 nt）和序列的DNA插入对Cas12a活性的影响；采用体外顺式切割实验验证了双链DNA（dsDNA）和超螺旋质粒中的插入耐受性；利用AlphaFold3进行蛋白质结构预测，比对AsCas12a与LbCas12a的WED结构域差异；通过构建系统发育树和多重序列比对分析23种Cas12a直系同源物的进化关系；并在HEK293T细胞中进行了基因组编辑实验以验证体内活性。

研究结果揭示：

AsCas12a耐受不同长度ssDNA靶标中的DNA插入

实验表明AsCas12a对含1-20 nt插入的ssDNA均保持反式切割活性，而LbCas12a和ErCas12a在插入≥3 nt时活性完全丧失。活性最低点出现在5 nt插入处，但7-20 nt插入时活性显著回升。

AsCas12a对插入的耐受具有序列非依赖性

使用聚A、聚T、聚G、聚C等不同序列的9 nt插入测试表明，AsCas12a对所有序列均保持活性（聚A活性最高，聚G最低），证明其耐受性不依赖插入序列的特异性。

独特结构特征与增强的灵活性相关

结构分析发现AsCas12a的WED域存在一个其他同源物缺失的α-螺旋（残基819-850）。删除该螺旋的突变体（AsΔ819-850）完全丧失插入耐受性，而将其移植至LbCas12a却未能赋予新功能，表明该螺旋是必要但不充分的条件。

ssDNA靶标中含插入的识别和切割存在位置敏感性

插入位置实验显示，当插入位于crRNA的5'端（Ins-0至Ins-4）或3'端（Ins-15至Ins-20）时，所有Cas12a变体均能有效切割，但AsCas12a还对中段位置（Ins-10至Ins-17）的插入具有独特耐受性。

LEAP实现PAM-flexible的dsDNA靶向

研究团队开发了"环增强可及性PAM"（LEAP）策略，通过设计含9-10 nt插入的crRNA，使AsCas12a能够跨越远距离PAM位点实现DNA切割。在体外实验中，含插入的dsDNA和超螺旋质粒均被成功切割，但在细胞编辑实验中活性显著降低，推测与染色质空间阻遏有关。

临床应用潜力：SNP检测

利用插入耐受性带来的结合敏感性提升，团队成功区分了KRAS G12D（ssDNA替代物）和TP53 R175H（dsDNA扩增子）的突变等位基因。含10 nt插入的crRNA将突变碱基置于pos-14/15时，实现了47倍（KRAS）和5.3倍（TP53）的信号差异，而传统DETECTR方法无法区分。

研究结论强调，AsCas12a的插入耐受性重塑了人们对CRISPR-Cas系统机制的理解，其独特的WED域α-螺旋是实现这一功能的关键结构基础。该发现不仅为开发PAM-flexible的基因组编辑工具提供了新思路，更推动了无需扩增的SNP检测技术发展。尤其在分子诊断领域，LEAP策略有望实现对癌症相关突变（如KRAS G12D和TP53 R175H）的高灵敏识别。尽管细胞内的编辑效率仍需优化，这项研究无疑为CRISPR-Cas12a的系统生物学研究和应用拓展奠定了里程碑式的基础。论文发表于《Nucleic Acids Research》，为基因编辑和分子诊断技术的创新提供了重要理论依据和实践方向。