综述：麻疹与风疹：从全球健康挑战到消除时代的分子诊断进展

本综述系统回顾了麻疹（Measles）和风疹（Rubella）这两种具有重大公共卫生意义的病毒性传染病。文章重点探讨了在全球消除背景下，从传统诊断技术（如ELISA、RT-PCR）到新兴分子诊断方法（如CRISPR-Cas、等温扩增、数字PCR（dPCR）、二代测序（NGS）及微流控芯片）的演进。作者强调了精准、及时诊断对于疫情控制、消除认证及免疫规划（如IA2030）的关键作用，并指出在资源有限地区部署快速诊断测试（RDT）和现场检测（point-of-care testing）所面临的挑战与机遇。

　　

MEASLES: VIROLOGY, GENETIC CHARACTERIZATION, AND CLINICAL FEATURES

麻疹病毒（MeV）是一种单股负链RNA病毒，属于副粘病毒科麻疹病毒属。其基因组长约15.9 kb，编码六种蛋白：核衣壳蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素蛋白（H）和大聚合酶蛋白（L）。其中H蛋白通过CD150和nectin-4受体介导细胞附着，F蛋白则负责膜融合。这些表面糖蛋白是中和抗体的主要靶标，使得麻疹病毒只有一个稳定的血清型。

世界卫生组织（WHO）将麻疹病毒株分为8个谱系（A-H），包含22个基因型。基因分型通常通过对N450区域或全长H基因进行测序来完成。疫苗株属于基因型A。全球监测数据显示，自2021年以来，只有基因型B3和D8仍在传播。

麻疹具有极强的传染性，一个感染者可在易感人群中传染12至18人。其临床特征始于2至4天的前驱期，表现为发热和“三个C”症状：咳嗽（Cough）、卡他（Coryza）和结膜炎（Conjunctivitis）。随后出现特征性的红斑状斑丘疹，通常从面部开始，蔓延至躯干和四肢。约70%的病例在出疹前1-2天会出现科氏斑（Koplik spots）。常见并发症包括中耳炎（7%-9%）、肺炎（1%-6%）、腹泻（8%）、感染后脑炎（1/1000）以及亚急性硬化性全脑炎（1/10000）。总体死亡率约为千分之一。高风险人群包括婴儿、20岁以上成人、孕妇、营养不良儿童和免疫功能低下者。

RUBELLA: VIROLOGY, GENETIC CHARACTERIZATION, AND CLINICAL FEATURES

风疹病毒（RuV）是一种有包膜的单股正链RNA病毒，属于风疹病毒属。其基因组长约9.8 kb，编码结构蛋白包括衣壳蛋白和包膜糖蛋白E1和E2。E1糖蛋白是免疫反应的主要靶标。风疹病毒同样只有一个稳定的血清型，这使得上世纪60年代开发的疫苗至今仍然有效。

风疹病毒被分为两个进化支和13个基因型。基因分型使用E1基因内的739个核苷酸（E1-739）进行。目前基因型1E和2B是全球最常见的。在2016年至2018年间，由于消除努力，流行基因型从五个减少到两个，但全球监测在非洲和东地中海等地区仍不完善。

风疹的临床表现通常较轻，约50%的感染无症状。有症状者通常表现为1至5天的前驱期，包括低热、头痛、不适、卡他、结膜炎和淋巴结病，随后出现轻微的斑丘疹。青少年和成人可能出现关节痛或关节炎。然而，妊娠早期（尤其是前16周）的原发性风疹感染可能导致流产、死产或先天性风疹综合征（CRS），后者具有重大的医学和公共卫生影响。

GLOBAL BURDEN OF MEASLES AND RUBELLA

麻疹和风疹仍然是全球性的疾病负担。自2024年以来，所有WHO区域都报告了麻疹病例数的增加，累计有395,521例实验室确诊病例。风疹是导致出生缺陷的主要疫苗可预防原因，全球估计每年有10万名婴儿因CRS出生。监测数据表明，病例报告不足现象严重，尤其是在资源有限地区。

HEALTH IMPACT OF THE MEASLES AND RUBELLA IMMUNIZATION PROGRAMS

免疫规划对减轻疾病负担产生了深远影响。2012年世界卫生大会批准的《全球疫苗行动计划》旨在到2020年至少在五个WHO区域消除麻疹和风疹。尽管所有WHO区域都设定了麻疹消除目标，但只有两个区域有针对风疹的具体目标。COVID-19大流行严重扰乱了常规疫苗接种计划和补充免疫活动（SIAs）。

到2024年，麻疹疫苗第一剂（MCV1）的全球覆盖率达到了84%，但仍低于实现群体免疫所需的95%目标。麻疹疫苗第二剂（MCV2）的覆盖率也稳步上升至76%。在2000-2023年期间，麻疹疫苗接种估计在全球防止了6030万死亡。然而，全球仍有1430万儿童未接种任何疫苗，这些“零剂量儿童”超过一半集中在尼日利亚、印度等九个国家。

对于风疹，斯坦利·普洛特金（Stanley Plotkin）在1965年至1967年间开发的RA27/3疫苗至今仍是使用最广泛的风疹疫苗。单剂接种的抗体应答率超过95%，而第二剂可将应答率提高到近100%。截至2024年1月，194个国家中有175个已引入风疹疫苗，全球覆盖率估计为69%。模型研究估计，2000年至2030年期间，风疹免疫可在112个国家预防120万CRS相关死亡。

为加强疾病控制，WHO优先控制腮腺炎，因此121个国家已将麻疹-腮腺炎-风疹（MMR）联合疫苗纳入国家免疫规划。这些疫苗可同时预防三种疾病，并通过减少所需注射次数和医疗访问来提高覆盖率。

MEASLES AND RUBELLA MICROARRAY PATCHES: AN ALTERNATIVE TO SYRINGE/NEEDLE SYSTEM

传统的麻疹和风疹疫苗需要冷藏（2°C-8°C）、复溶和熟练的注射人员，这在低收入和中等收入国家（LMICs）构成挑战。麻疹和风疹微阵列贴片（microarray patches）是硬币大小的贴片，带有微针，可以通过拇指压力无痛地将疫苗输送至皮肤。它们具有热稳定性、无针、无需复溶，并且可由经过最低限度培训的工作人员进行给药。二期试验显示，在≥9个月的儿童中，其安全性和免疫原性与注射相当。

COST-EFFECTIVENESS OF THE MEASLES AND RUBELLA IMMUNIZATION PROGRAMS

经济评估一致表明，麻疹和风疹疫苗接种规划是具有高度成本效益的公共卫生干预措施。这些规划在不同的全球环境中带来了巨大的财务效益。麻疹爆发的成本因地区而异，从巴西的每例2979美元到美国的超过33,000美元不等。即使在低发病率时期，年度支出也超过200万美元。

成本效益分析显示出显著的投资回报。来自73个中低收入国家（LMICs）的全球数据显示，在麻疹免疫上每投资1美元可节省58美元。中国的扩大免疫规划（1974-2024）表明，从社会角度和医疗保健角度看的 benefit-cost ratios 分别为27.75和15.44。

对于风疹预防，经济模型表明有显著的节约潜力。中等收入国家每年每例可节省4200至57,000美元。高收入环境显示每预防一例终身病例可节省高达140,000美元。

GLOBAL LABORATORY-BASED SURVEILLANCE AND DIAGNOSTIC WORKFLOW

随着疫苗覆盖率的提高，麻疹的临床诊断变得越来越困难。准确的实验室诊断对于有效的病例管理和公共卫生干预至关重要。麻疹的诊断对医疗保健提供者构成了重大挑战，特别是对于那些临床经验有限的人。这些困难在感染的早期阶段（特征性皮疹出现之前）尤为明显。

诊断过程在非典型病例中进一步复杂化，例如具有残留母体抗体的婴儿、最近接受过免疫球蛋白的个体以及最近接种过疫苗的人。在免疫缺陷患者中，特征性皮疹可能缺失。临床鉴别因症状重叠的疾病而变得复杂，包括风疹、登革热、细小病毒B19、HHV-6和疫苗接种反应。

美国疾病控制与预防中心（CDC）将疑似麻疹定义为全身性斑丘疹、发热≥38.3°C以及至少伴有咳嗽、卡他或结膜炎之一。虽然其敏感性为75-90%，但其阳性预测值在低流行地区有限，因此需要进行实验室确认。

一旦临床怀疑，应立即实施感染控制措施，通知公共卫生当局，并分配唯一的病例标识符用于监测跟踪。CDC建议从所有具有兼容麻疹临床特征的患者身上收集鼻咽拭子、喉拭子或尿液标本以及血液标本。鼻咽或喉拭子优于尿液标本。在皮疹出现第一天至出现后3天内收集标本时，麻疹RNA检测最成功，尽管实时RT-PCR在皮疹出现后10-14天内仍然可行。

实施双重检测方法，即同时采用血清学和分子方法，以最大限度地提高诊断准确性。

CLINICAL SPECIMEN TYPES FOR MEASLES AND RUBELLA DIAGNOSIS

对于麻疹，临床样本包括喉/鼻拭子、鼻咽抽吸物、口腔液、尿液或外周血单核细胞（PBMCs）。当冷链维护具有挑战性时，干血斑（DBSs）为基于IgG的血清学检测提供了血浆的可行替代方案。DBS对腮腺炎和麻疹显示出高灵敏度（均为100%），对风疹为82.5%，对腮腺炎和风疹的特异性为100%，对麻疹为87.5%，与血浆结果有很强的相关性（r=0.914-0.953）。

样本也可点样到FTA（Flinders Technology Associates）elute微卡上，这些卡可以保存病毒RNA并灭活病毒，实现环境温度下的安全运输。MeV RNA在皮疹出现后最多7天可在血清中检测到，在其他样本中最多可达2周或更长时间。强烈建议尽早采集样本，最好在皮疹出现后不久。

风疹病毒检测使用与麻疹相同的临床样本，允许同时调查两种感染。样本采集相对于疫苗接种的时间对诊断解释至关重要。疫苗病毒RNA可在接种后7-14天在呼吸道样本中检测到，而疫苗诱导的抗体反应可能持续数周至数月。WHO建议避免在MMR疫苗接种后6周内进行血清学检测，除非可获得RT-PCR确认。

TRADITIONAL DIAGNOSTIC METHODS WITH LIMITED CLINICAL UTILITY

尽管灵敏度较低且耗时，但当需要高病毒滴度或全面的病毒特征时，病毒分离在细胞培养中仍然有价值。MeV可以使用B95a和Vero/hSLAM细胞系从鼻/喉拭子、鼻咽抽吸物、尿液或PBMCs中进行培养。

对于风疹，该病毒可以在RK13、SIRC、幼仓鼠肾以及Vero或Vero/hSLAM细胞系中传代。与麻疹不同，风疹野毒株很少引起可见的细胞病变效应（CPE），即使是适应株也可能需要5天才能在35°C形成斑块。因此，通常需要额外的技术来确认，例如RT-PCR、免疫荧光或免疫比色测定（ICAs）。

DIAGNOSTIC GOLD STANDARDS AND THE GAPS

本综述讨论的诊断方法可分为三个基本原理：基于抗体的检测、中和试验和核酸检测。尽管我们按时间顺序呈现这些方法以说明技术演变，但读者应注意，共享相同基本原理的方法通常具有类似的约束和能力。

ENZYME IMMUNOASSAY

酶免疫测定（EIA），也称为ELISA，代表了一种基本的免疫分析技术，利用酶的催化特性来检测和量化免疫反应。在这种异相免疫测定形式中，反应组分之一被非特异性吸附或共价结合到固相表面。固相通常由96孔或384孔聚苯乙烯微孔板组成。

商业ELISA平台使用重组麻疹核衣壳（N）蛋白和风疹E1包膜糖蛋白作为主要捕获抗原。这些平台采用间接和捕获ELISA形式，其中捕获测定通过消除类风湿因子和其他非特异性抗体的干扰而表现出卓越的特异性。

麻疹特异性IgM抗体的检测灵敏度为83%-89%，特异性为95%-99%。横断面研究表明，灵敏度因样本采集时间而异，最佳检测发生在皮疹出现后3-7天IgM水平达到峰值时。现代捕获EIA的分析灵敏度对于麻疹IgM接近0.1-0.5 IU/mL，同时保持与其他副粘病毒的低交叉反应性。

然而，高达25%的病例在皮疹出现后72小时内可能没有IgM，并且在低发病率地区可能出现假阳性。假阳性IgM结果在消除环境中尤其成问题，因为阳性预测值急剧下降。常见原因包括对其他病毒感染的异型免疫反应、产生类风湿因子的自身免疫性疾病以及最近接种减毒活疫苗。

IgG检测通过配对血清中4倍滴度升高或血清阳转来确认近期感染。IgG定量通常采用参考WHO标准的标准化的国际单位（IU/mL），一般认为麻疹≥200 mIU/mL和风疹≥15 IU/mL具有保护性免疫力。

IgG亲合力测试可区分近期（低亲合力）感染与既往感染或疫苗接种（高亲合力）。IgG亲合力测试采用离序剂（如尿素或二乙胺）来破坏近期免疫反应特征性的弱抗原-抗体键。

PLAQUE REDUCTION NEUTRALIZATION

斑块减少中和试验（PRNT）是定量评估麻疹免疫力的金标准，比血凝抑制（HI）测定具有更高的灵敏度。PRN测定测量抗体在细胞培养（通常使用Vero细胞）中中和活MeV感染性的能力。

对于风疹，免疫比色中和试验是评估中和免疫力的金标准。该测定采用带有颜色变化指示剂的细胞培养来检测细胞病变效应，提供中和抗体的半定量评估。

产后风疹使用RT-PCR或病毒分离从鼻、喉或尿液样本中进行诊断，理想情况是在皮疹出现后3天内。应对患有白内障、先天性心脏缺陷或听力损失的婴儿怀疑CRS。CRS诊断涉及在接种疫苗前6个月内检测到风疹特异性IgM或IgG滴度上升。

IgM检测最为常见，但由于与细小病毒B19、类风湿因子或异嗜性抗体的交叉反应，可能出现假阳性。IgG亲合力测试可区分近期和既往感染，但在低发病率环境中效用有限。此外，近期的MMR疫苗接种可能由于疫苗诱导的抗体反应而导致最多6-8周的假阳性IgM结果。

RT-PCR

RT-PCR将病毒RNA反转录为cDNA，然后通过热循环进行指数扩增。对于麻疹和风疹诊断，首选一步法RT-qPCR方案，在单个反应管中使用反转录酶和耐热DNA聚合酶，并进行实时荧光检测。

标准麻疹RT-qPCR采用双探针TaqMan化学法，靶向高度保守的核衣壳（N）基因区域（核苷酸1233-1462）。该区域在所有流行基因型中显示<2%的序列变异，确保广谱反应性的同时保持10-100拷贝/mL的分析灵敏度。

实时RT-PCR，特别是基于TaqMan的测定，是首选方法，因为它速度快（1-2小时出结果），操作最少从而降低污染风险，并且尽管RNA降解仍能扩增短基因组片段。结合疫苗特异性探针的实时PCR测定可在2-3小时内明确识别基因型A株，这对于消除环境至关重要，因为快速区分对于疫情调查至关重要。

多重RT-PCR格式在消除环境中被证明是有优势的，因为疑似病例可能由其他病原体引起。靶向麻疹、风疹、细小病毒B19、HHV-6和肠道病毒的多重Panel为发热出疹性疾病提供了全面的鉴别诊断。

对于风疹，基于TaqMan和巢式RT-PCR测定对次优样本或低病毒载量具有高灵敏度，但需要 meticulous 的污染控制。E1基因靶标（核苷酸8731-9469）使用设计用于检测两个系统发育支的引物组。

RT-PCR的准确性受采集时间、样本类型、储存和运输条件的影响。如果样本采集较晚、储存不当或含有极少量或突变的病毒RNA，可能会出现假阴性结果。

ADVANCES IN MEASLES AND RUBELLA MOLECULAR DIOSTICS

全球麻疹和风疹实验室网络（GMRLN）成立了一个工作组来开发和部署用于麻疹和风疹的快速诊断测试（RDTs）。该小组为将RDT引入国家监测规划创建了一个框架。这些测试有望提高监测的及时性和灵敏度。

该网络确保实验室能够将实时RT-PCR用于病例确认算法。它还支持生成高质量的序列数据以监测病毒传播途径。实施了下一代测序（NGS）以加强疫情调查。

当冷链维护具有挑战性时，验证了替代样本类型，如干血斑（DBSs）和口腔液，并开发了现场护理检测用于资源有限环境下的分散诊断。这种全面的工作流程提供了系统的、有质量保证的诊断，同时支持全球消除工作。

这些新方法与传统技术相比提供了更高的灵敏度。它们还提供了改进的特异性以实现准确检测。这些创新实现了更早的检测、改进的基因分型和更准确的疫情追踪。通过克服传统血清学和RT-PCR的局限性，这些分子工具支持及时的公共卫生应对，并正逐步被纳入监测系统。

CHEMILUMINESCENCE IMMUNOASSAY

化学发光免疫测定（CLIA）是一种高灵敏度、快速的诊断方法，利用发光的化学反应来检测特异性抗体或抗原。这项技术代表了靶点保守与方法学进步。它使用与传统ELISA相同的N蛋白和E1糖蛋白抗原，但采用化学发光检测以增强灵敏度和自动化能力。

AUTOMATABLE FOCUS REDUCTION NEUTRALIZATION TESTS

PRNT和ELISA通常用于评估麻疹免疫力，但原理不同。ELISA测量抗体与病毒成分的结合，而PRNT评估抗体阻断病毒感染的能力。尽管PRNT是检测MeV中和抗体的金标准，但它 labor intensive、速度慢且技术要求高。

为解决这些局限性，开发了聚焦减少中和试验（FRNT），使用免疫比色测定（ICA）来检测受感染细胞。

LATERAL FLOW-BASED RDTs

基于侧向流动的快速诊断测试（RDTs）越来越多地被用于通过靶向特异性抗体或抗原来检测感染，如疟疾、COVID-19和HIV。这些测试在室温下操作，无需复杂的电气设备。它们消除了样本运输过程中对反向冷链系统的需求。执行这些测试只需要最低限度的技术培训。这使它们成为低资源环境的理想选择。

侧向流动免疫测定基于毛细管作用和抗原-抗体结合动力学运作。测试装置由四个主要部分组成。样品垫允许样本应用。结合垫含有金纳米颗粒标记的检测抗体。硝酸纤维素膜上有固定的捕获抗体，形成测试线和控制线。吸收垫在整个过程中维持毛细管流动。

当施加样本时，目标抗原与金标记抗体形成免疫复合物。该复合物沿着膜迁移，并被固定抗体在测试线捕获。这产生一条可见的色带指示阳性结果。

侧向流动RDTs代表了靶点保守与检测简化。它靶向与实验室EIA相同的麻疹N蛋白特异性IgM抗体。测试使用固定在测试线上的重组N蛋白抗原。它能在30分钟内实现快速的现场检测。无需仪器即可视觉判读结果。这种方法在实现分散检测的同时保持了与参考方法的诊断等效性。

该测定设计结合了针对人IgM重链的特异性捕获和检测抗体。这确保了类别特异性抗体检测，并最大限度地减少了与其他免疫球蛋白类别的交叉反应性。

多基质兼容性源于测定在不同样本类型中通常发现的IgM抗体浓度的检测能力。这些测试可以利用血清和口腔液样本进行灵活的样本采集。口腔液采集装置使用一个特殊的垫子。该垫子吸收约1 mL口腔液。然后将液体在缓冲液溶液中萃取。缓冲液含有稳定剂和抗菌防腐剂。这些成分在运输过程中维持样本完整性。

REVERSE TRANSCRIPTION DROPLET DIGITAL PCR

反转录微滴式数字PCR（RT-ddPCR）代表了一种先进的分子诊断技术，它将数字PCR（dPCR）技术的精确性与通过反转录检测RNA靶标的能力相结合。RT-ddPCR是dPCR的一种专门应用。它专门针对像麻疹和风疹这样的RNA病毒的诊断需求。该方法提供直接、绝对和精确的病毒RNA测量。它无需标准曲线或参考对照。

RT-ddPCR利用基于微滴的分区技术。样本首先经过反转录将病毒RNA转化为cDNA。然后使用油水乳液技术将样本分割成大约20,000个纳升大小的微滴。每个微滴作为一个独立的PCR微反应器，能够以前所未有的准确性和灵敏度检测和量化目标病毒序列。

分析微滴的荧光信号，每个微滴被分类为阳性（含靶标）或阴性（无靶标）。浓度使用泊松统计根据阳性与阴性微滴的比率计算。这种方法消除了对标准曲线的需求，并提供了与传统方法相比卓越的精度的绝对定量。

ISOTHERMAL AMPLIFICATION AND CRISPR-CAS-BASED APPROACH

反转录环介导等温扩增（RT-LAMP）基于使用Bst DNA聚合酶的链置换DNA合成原理。该酶同时具有5'到3'聚合酶活性和链置换活性，但缺乏5'到3'外切酶活性。这使得通过形成具有多个环的茎环结构，在恒温下实现连续扩增，创建目标序列串联反向重复的特征性花椰菜样结构。

该测定使用六条引物靶向麻疹N基因的核苷酸400-800。这些引物识别该区域内的八个 distinct 序列。这提供了与常规RT-PCR相比更高的特异性。六引物系统包括两条外引物（F3/B3）、两条内引物（FIP/BIP）和两条环引物（LF/LB）。它们共同识别八个 distinct 序列。

为了进一步提高等温扩增方法固有的特异性并减少假阳性结果，CRISPR-Cas系统已被集成为二次确认步骤，提供可编程的基于核酸酶的靶标验证。

MULTIPLEX BEAD ASSAY

多重微球测定（MBA）基于悬浮芯片免疫测定原理。它使用颜色编码的聚苯乙烯微球（直径5.6 μm）作为固相支持。每个 distinct 微球群内部用两种荧光染料的独特比例进行染色。微球与特定病毒抗原偶联，例如麻疹或风疹蛋白。

测定工作流程包括将患者血清与抗原偶联的微球混合物孵育以允许抗体-抗原结合。随后使用生物素化的二抗和链霉亲和素-藻红蛋白（PE）缀合物进行检测，产生与抗体浓度成比例的荧光信号。双激光流式细胞仪系统同时通过内部染料分类（635 nm激光）识别微球群，并量化报告信号强度以确定抗体浓度。这使得能够在单个反应中使用最少量血清（1-5 μL）测量多达100种不同的分析物。

MICROFLUIDIC CHIP-BASED DETECTION

用于麻疹和风疹检测的微流控芯片检测代表了一种新兴且极具前景的诊断方法，它利用微加工技术创建微型化、集成化的平台，能够在 confined 微尺度通道内执行复杂的生化分析。该技术基于微通道（通常尺寸为1-1000 μm）内的精确流体操纵和控制原理。这使得能够在单个便携设备中完成从样本到答案的完整分析，与传统实验室方法相比，显著减少样本消耗，缩短反应时间，并提高检测灵敏度。

最近的进展展示了两种主要的麻疹和风疹检测微流控方法。第一种方法使用数字微流控（DMF）系统，利用静电力操纵离散液滴实现自动化免疫测定。第二种方法利用连续流微流控芯片，集成多个分析步骤。这些芯片包括核酸扩增和抗体检测能力。

NEXT-GENERATION SEQUENCING

全基因组测序（WGS）代表了麻疹和风疹监测最全面的分子方法