应用长读长测序与结构建模对PAH基因新型结构变异进行遗传学与功能预测研究

本研究利用纳米孔长读长测序（nCATS）与CRISPR/Cas9靶向富集技术，首次对智利PKU患者中发现的PAH基因外显子2串联重复变异（～18 kb）进行精确定位与结构解析，并通过蛋白质结构建模预测该变异可能通过N端延伸干扰苯丙氨酸（Phe）感应域（ACT domain）功能，为基因型-表型关联研究和个性化治疗策略提供了新依据。

　　

引言

苯丙酮尿症（PKU）是一种常染色体隐性遗传代谢病，由PAH基因双等位基因变异引起，导致苯丙氨酸（Phe）积累和进行性神经损伤。PAH基因编码苯丙氨酸羟化酶（PAH），该酶催化Phe转化为酪氨酸（Tyr），并需要辅因子四氢生物蝶呤（BH₄）参与。截至2025年2月，BIOPKU数据库已收录超过3,450种PAH基因变异，其中单核苷酸替换占80.5%。智利此前通过MLPA技术发现一例未报道的外显子2重复变异，但其遗传特征与功能影响尚未明确。

材料与方法

2.1 临床数据与患者诊断

八名携带PAH基因外显子2重复变异的PKU或高苯丙氨酸血症（HPA）患者参与本研究，其血浆Phe水平介于3.5–38 mg/dL，Phe/Tyr比值介于0.58–10.45。所有患者均为复合杂合子，其中三例患者的另一等位基因变异已被鉴定（p.Arg243Gln、p.Arg261Gln、p.Val388Met），其余五例的第二变异尚在研究中。

2.2 纳米孔CRISPR/Cas9靶向测序（nCATS）

采用CRISPR/Cas9技术对患者基因组DNA进行靶向富集，使用特异性gRNA切割PAH基因第1–3外显子区域。通过纳米孔MinION测序仪进行长读长测序，使用Guppy进行碱基识别，并通过Sniffles、NanoVar等工具进行结构变异（SV）检测与断点精确定位。

2.3 变异验证与蛋白建模

通过PCR扩增和Sanger测序验证所有患者中重复连接的序列一致性。利用ChimeraX软件，以PDB:6n1k为模板，对野生型PAH及其携带外显子2重复的变异体进行三维结构建模，预测其功能影响。

结果

3.1 纳米孔测序检测结构变异

nCATS测序成功获得27,587条高质量读长，其中14条读长支持一个17,788 bp的串联重复事件，位于染色体12q23.2（GRCh38.p13:102,895,995–102,913,786）。该重复覆盖整个外显子2及其侧翼内含子区域。

3.2 PCR验证与连接点分析

所有八名患者均通过特异性PCR扩增得到571 bp的条带，证实重复连接的存在。Sanger测序进一步显示，所有患者在重复连接处均有一个腺嘌呤（A）插入，序列描述为：NC_000012.12:g.102895995_102913786dup [NC_000012.12:g.102895994insA]。

3.3 蛋白结构建模与功能预测

结构建模显示，外显子2重复导致PAH蛋白N端延伸出一段无规则二级结构的肽段。该延伸可能干扰调节域（ACT domain）的构象变化与Phe感应功能，但整体蛋白结构仍保持完整。变异未引起移码，提示转录本可能正常翻译。

讨论

本研究首次精确表征PAH基因中外显子2的串联重复变异，其发生机制可能与内含子区域内Alu元件的同源重组有关。所有患者均携带一致的重复与A插入，提示其可能为 founder 变异。尽管患者另一等位基因携带已知致经典PKU的错义变异，但其临床表现多为轻中度，提示该重复等位基因可能保留部分酶功能。

结构建模表明，重复所引入的N端延伸可能影响ACT结构域与BH₄辅因子的结合，进而干扰酶活调节与四聚体构象变化。这一发现为理解该变异的分子机制提供了结构基础，也为其可能对沙丙蝶呤（sapropterin）治疗缺乏响应提供了假设依据。

目前该变体的功能预测仍依赖同源建模，因PAH蛋白N端1–18位氨基酸在原晶体结构中未被解析，且现有工具难以准确预测片段重复带来的构象变化。后续需通过细胞模型（如HepaRG肝细胞系或iPSC来源肝细胞）进行体外酶活测定与结构解析，以验证其功能影响。

该变异的鉴定与表征为智利乃至国际PKU患者的基因诊断、表型预测与个体化治疗提供了重要依据，尤其在高结构变异频率的人群中，MLPA与PCR验证可作为低成本筛查策略。