基于哑铃探针转录与CRISPR/Cas13a诱导G-四链体切割的结构特异性FEN1电化学发光生物传感器

本研究开发了一种新型电化学发光（ECL）生物传感器，通过整合哑铃探针介导的转录与CRISPR/Cas13a系统，实现了对Flap endonuclease 1（FEN1）酶活性的高灵敏度、结构特异性检测。该平台利用Ru(II)/Ti3C2/AuNPs修饰电极和G-四链体/血红素（hemin）复合物淬灭机制，在癌症诊断和酶活性分析领域展现巨大潜力。

　　

Chemicals and materials

本研究使用的所有DNA和RNA寡核苷酸均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列详见表S1。四氯金酸三水合物（HAuCl₄·3H₂O）、三正丙胺（TPrA）和硼氢化钠（NaBH₄）购自阿拉丁生化科技有限公司（上海）。Ti₃C₂-MXene分散液由南京先丰纳米材料科技有限公司提供。三(2,2'-联吡啶)二氯化钌六水合物（Ru(bpy)₃Cl₂·6H₂O, 98%）用于电化学发光体系构建。

Mechanism of the Electrochemical Biosensor

本研究开发了一种新型ECL生物传感器，通过整合结构特异性识别、酶介导放大和CRISPR/Cas13a信号转导机制，实现FEN1的高灵敏度检测（如方案1所示）。传感策略始于设计一种具有三分支结构的哑铃状DNA探针（BDP），其包含6核苷酸5′- flap和1核苷酸3′- flap。BDP左环编码crRNA生成固定域，右环则作为T7 RNA聚合酶启动子区域。当FEN1存在时，其特异性切割5′- flap结构产生可连接末端，经T4 DNA连接酶环化后形成闭合转录模板。T7 RNA polymerase随后以该模板转录生成大量含crRNA序列的RNA产物，这些转录本与预存的激活RNA杂交后激活Cas13a核糖核酸酶。激活的Cas13a发挥反式切割活性，降解电极表面固定的RNA G-四链体/血红素复合物，导致血红素释放并恢复被淬灭的ECL信号。这种级联设计实现了对FEN1酶活性的无标记、结构特异性超灵敏检测。

Conclusions

本研究成功构建了一种结构特异性ECL生物传感器，通过耦合哑铃DNA探针、T7 RNA聚合酶介导的转录放大和CRISPR/Cas13a诱导的反式切割，实现了FEN1酶的超灵敏检测。当FEN1识别并切割5′- flap结构后，产生的中间体经T4 DNA连接酶环化，并被T7 RNA聚合酶转录为crRNA序列。这些RNA转录本激活Cas13a，进而切割电极表面固定的G-四链体结构，最终通过ECL信号变化实现定量检测。该传感器展现出4.82×10^-9 U μL^-1的超低检测限和1×10^-8至1×10^-5 U μL^-1的宽线性范围，兼具优异特异性与稳定性。在人血清样本中的成功应用验证了其对复杂生物样品的检测可靠性，为癌症诊断、酶活性分析和DNA修复机制研究提供了强大技术平台。