综述：作为可持续甲醇生物转化生物催化剂的Eubacterium limosum

本综述系统探讨了甲基营养型产乙酸菌Eubacterium limosum作为甲醇生物转化平台的应用潜力。文章重点解析了其遗传工具开发（CRISPR-Cas、重组工程系统）、甲醇代谢途径（Wood-Ljungdahl途径、甲基转移酶系统MtaABC）和混合营养策略（与甲酸盐/葡萄糖共底物利用）的最新进展，为可持续生物制造和碳负排放技术提供了新方向。

　　

引言

微生物利用一碳（C1）底物（包括CO₂、CO、甲酸盐和甲醇）进行碳负化学品的生产已成为可持续生物制造的重要策略。其中甲醇因其低成本、高水溶性和高还原度（比葡萄糖多提供50%电子）而备受关注，特别适用于生产高还原性生化品（如醇类和长链羧酸盐）。微生物甲醇转化存在好氧和厌氧两条途径，而厌氧途径凭借其高能量效率（80-90%）和无需曝气的特性，在工业应用中更具优势。

Eubacterium limosum作为甲醇生物转化的平台生物催化剂

在产乙酸菌中，E. limosum展现出卓越的代谢多样性：它能利用C1底物（CO₂/CO/甲酸盐/甲醇）自然生产丁酸、己酸和丁醇等高值还原化合物。其甲醇生长速率（0.11 h^-1）优于多数产乙酸菌，且兼具CO利用和长链代谢物合成能力。目前主要研究菌株包括模式菌株DSM 20543^T和B2菌株。

近年来其遗传工具开发取得突破性进展：

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  基因组编辑：CRISPR-Cas系统实现WLP途径基因100%敲除效率；RecT重组工程系统实现无标记无缝编辑；Cre-Lox系统成功整合11 kb非核糖体肽合成酶基因簇

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  表达调控：化学诱导（aTc/乳糖）启动子系统、CO气体感应转录开关、天然启动子/UTR库

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  报告系统：氧不敏感荧光蛋白（CreiLov/HaloTag/FAST）和酶学报告基因（BgaB/CatP）

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  转化效率：通过优化电穿孔方案和生物膜缺陷突变（ΔepsABC等）提升3000倍

多组学分析揭示了其在不同营养条件下的全局调控机制：

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  表观基因组：PacBio测序揭示甲基化组变化

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  转录组：RNA-seq/dRNA-seq/Term-seq解析转录起始/终止位点

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  翻译组：Ribo-seq分析自养/异养条件下的翻译效率

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  蛋白质组：Direct-DIA技术定量批次/恒化培养中的蛋白表达

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  代谢组：LC-MS/MS分析胞内外代谢物动态

  结合热力学代谢流分析（tMFA）和深度学习模型，成功识别出甲醇同化瓶颈和代谢限制因素。

甲醇代谢与生化品转化

E. limosum的甲醇代谢始于甲基转移酶系统（MtaABC）将甲基从甲醇转移至四氢叶酸（THF）形成甲基-THF，随后通过还原途径（生成乙酰-CoA）或氧化途径（逆WLP甲基分支产生电子和CO₂）进行代谢。值得注意的是，单独甲醇无法维持生长，需要CO₂或甲酸盐等氧化共底物维持代谢平衡。

天然代谢产物包括：

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  乙酸：通过乙酸激酶（Ack）产生ATP

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  丁酸/己酸：作为电子汇通过bcs/hcs操纵子实现链延长

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  丁醇：在甲醇/甲酸盐共培养条件下微量产生

  有机酸添加可定向调控产物谱：乙酸促进同丁酸发酵，丙酸/丁酸分别选择性增强戊酸/己酸合成。通过异源表达AdhE dehydrogenase成功实现甲醇产丁醇（含痕量乙醇）。此外，甲醇培养下的维生素B₁₂产量（3.4 mg/gDCW）显著高于葡萄糖培养，反映出甲醇代谢中钴胺素依赖性甲基转移酶通量的提升。

甲醇混合营养提升能量利用率

混合营养（Mixotrophy）通过共底物策略有效增强能量供应：

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  葡萄糖共培养：恒化器生长速率提升1.5倍，补料批次细胞密度和乙酸生产率翻倍

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  CO共培养：细胞密度提高1.5倍，乙酸生产率增长2倍

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  甲酸盐共培养：最佳甲醇/甲酸盐比例（7.5-10:1）时丁酸/己酸/丁醇产量显著提升，甲醇摄取率提高2.5倍

关键挑战在于避免底物利用的双峰生长现象（Diauxie）。通过控制进料策略（如0.1 mM/h连续葡萄糖供给）和优化比例可实现同步利用。需进一步探究碳分解代谢抑制（CCR）在产乙酸菌中的调控机制。

结论与展望

尽管E. limosum在工业应用上仍落后于C. autoethanogenum等成熟平台，但其强大的代谢可塑性和快速发展的合成生物学工具使其具有巨大潜力。未来发展方向包括：

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  通过自动化生物铸造厂（Biofoundry）和iPROBE无细胞系统加速工程菌株构建

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  消除酵母提取物依赖（占培养基成本22%）以提升经济性

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  利用适应性实验室进化（ALE）增强酸耐受性（pH<6）和高甲醇浓度适应性

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  挖掘醛:铁氧还蛋白氧化还原酶（AOR）在酸性条件下催化醇合成的潜力

  通过整合代谢工程、高通量筛选和进化策略，E. limosum有望成为甲醇生物增值的工业化生物催化剂，推动循环碳经济发展。