综述：传统育种与分子技术相结合：一种综合方法

本综述系统阐述了将传统育种与现代分子技术（如CRISPR-Cas9基因组编辑、标记辅助选择MAS、全基因组测序、RNA干扰RNAi、转基因方法、高通量表型分析HTP及突变育种）相整合的策略，旨在应对全球人口增长和气候变化对粮食安全带来的挑战。文章重点分析了这些技术在提高作物产量、抗逆性（生物/非生物胁迫）及品质改良中的精准性、效率与速度优势，为可持续农业提供理论依据和技术路径。

　　

传统育种与分子技术相结合：一种综合方法

引言

全球人口预计到2050年将增至97亿，粮食需求较当前水平增加近70%。快速增长的人口、可耕地减少、土壤退化、水资源短缺以及气候变化的不利影响（包括全球变暖和天气模式变化）给粮食生产带来巨大挑战。作物植物因全球气候条件变化而遭遇各种非生物和生物胁迫，导致其生长、生产力和产量大幅下降。气候条件恶化，包括大气CO₂水平升高、热胁迫、温度波动和不规则降雨模式，进一步制约了高产和气候适应性品种的开发。确保粮食安全与环境可持续性已成为研究人员面临的重大挑战。

植物育种被视为最古老的人类活动之一，可追溯至约1万年前。传统育种在提高作物产量、增强对非生物和生物胁迫的耐受性以及缩短作物生命周期方面取得了显著成就。然而，传统方法耗时耗力，尤其对于低遗传力性状，过程相对低效。传统育种方法严重依赖表型，由于基因型与环境互作的影响，选择容易出错。为应对这些挑战，最近的科学进展极大地扩展了植物育种的可能性并推动了重大创新。

CRISPR介导的基因组编辑

CRISPR/Cas9基因组编辑技术是“成簇规律间隔短回文重复”的缩写，由短重复遗传物质序列组成。它天然存在于大多数古菌和许多细菌物种中。CRISPR/Cas9及其相关蛋白构成一个高效的防御系统，保护植物免受病毒、细菌和其他有害元素的侵害。CRISPR/Cas9通常用于在系统中引入特定靶基因的突变。该系统由两个关键组件组成：核酸内切酶（Cas9）和靶向特异性RNA（称为单导RNA sgRNA）。CRISPR/Cas9组件以DNA或RNA形式引入植物细胞，实现精确基因组编辑。该系统策略性地在特定位点切割植物DNA，触发细胞自然修复机制以恢复基因组完整性。修复通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）进行时，可能产生小的插入或缺失，导致基因突变。修复完成后，驱动等位基因复制到野生型染色体上，有效替换基因组中的原始野生型DNA序列。

Cas9的使用需要原间隔区邻近基序（PAM）序列位于靶位点附近并直接对齐。为确保有效靶向，不同的间隔序列至关重要。由于这些特性，CRISPR/Cas9以其快速、高效、经济和多用途而广受认可。CRISPR/Cas介导的基因组编辑已用于改善水稻、小麦、玉米和马铃薯等主要作物的产量、胁迫恢复力和抗病性等性状。

尽管CRISPR/Cas9具有革命性，但它并非没有缺点。一个主要挑战仍然是脱靶效应的发生，即无意中修改了非目标基因组区域。Cas9蛋白为何切割某些脱靶位点而不切割其他位点仍是一个谜。由于已证明Cas9在开放染色质区域更有效地切割，染色质形状可能是影响Cas9切割的重要因素。由于多倍体植物可能产生仅有一个核苷酸错配的同源等位基因，倍性水平可能对脱靶效应的发生有更大影响。修改这些序列之一可能会增加发现脱靶影响的可能性。但由于目标通常是修改所有同源等位基因，研究人员可以寻找所需的脱靶切割。此外，将CRISPR组件有效递送到植物细胞中仍然是一个技术挑战，特别是对于转化抗性物种。由于国家政府限制和技术挑战，基因组编辑作物的商业化受到质疑。伦理问题也出现，特别是在食品安全、公众认知和未知生态后果方面。如果CRISPR技术要在农业中成功且负责任地应用，这些问题需要解决。

标记辅助选择（MAS）

世界人口的逐渐增长强调了粮食需求，这揭示了在短时间内开发具有特定性状的改良品种的必要性。在传统育种中，种植数百甚至数千株植物群体。处理如此庞大的群体效率低下且耗时。因此，需要新方法的实用性来帮助植物育种家。标记辅助选择（MAS）是在DNA标记的帮助下操纵参与理想性状表达的基因组区域的过程。MAS促进表型选择，其方式有效、可靠且成本效益高，使该过程优于传统植物育种。MAS需要目标性状与分子标记之间的相关性，这可以通过遗传作图群体的表型分析 followed by Quantitative Trait Loci (QTL)作图来实现。

分子标记是特定的DNA序列，可被识别并用于检测个体之间的变化。理想的分子标记应具备许多特征：1. 多态性且在基因组中均匀分布；2. 简单、快速且不昂贵；3. 跨组织稳定且可识别；4. 不受环境、多效性和上位性影响。遗传标记分为两类：一类是经典标记，另一类是分子/DNA标记，其中经典标记进一步分为形态学、生物化学、细胞学标记，而限制性片段长度多态性（RFLP）、扩增片段长度多态性（AFLP）、简单序列重复（SSRs）、单核苷酸多态性（SNP）和多样性阵列技术（DArT）标记是分子标记的例子。RAPD标记通过使用短引物随机扩增基因组DNA获得。它也被称为通用引物。RAPD的主要缺点是重现性低。AFLP覆盖整个基因组，显性/共显性，多态性水平高。AFLP可以克服RAPD重现性低的问题。SSRs是1到6个核苷酸DNA基序的串联重复。它具有共显性、相对丰度和染色体特异性位置，可以直接从基因组DNA文库中衍生。通过单核苷酸替换获得的标记称为SNPs。这些类型的标记不需要先前的遗传信息。DArT是一种基于杂交的微阵列分子标记，可以独立于序列工作，使用便宜，但能带来快速结果。

MAS遵循几个步骤，包括亲本系的选择、作图群体的开发、多态性标记的鉴定以及标记的连锁分析。MAS的过程包括选择具有目标性状的杰出品系与测试种杂交，进行QTL作图，包括作图群体的开发、多态性标记的鉴定和标记的连锁分析。

与传统植物育种相比，MAS提供了有效、替代、廉价、更快和精确的选择效率，通过加速育种周期。该方法具有快速消除无关品系的优越性，使育种家能够只关注有希望的材料。此外，当所需性状遗传力低、隐性且需要基因金字塔时，MAS是一种非常可靠的植物育种方法。它是使用DNA标记评估基因型间遗传变异性和多样性的非常强大的方法。在MAS中，使用DNA标记检测杂种优势群体是可能的，并且这种育种方法不依赖环境，使得可以全年评估对生物和非生物障碍的抗性。许多品种已经在MAS的祝福下发布，例如水稻、玉米、小麦等，其中特定性状得到改善，例如抗病性、更高产量等。然而，这个过程也有一些缺点。大多数分子标记由于在广泛规模上的不可获得性和昂贵性，不能 readily 用于植物育种。标记开发和实施的初始成本高，特别是对于复杂性状的改良。改变植物育种家利用MAS的态度也至关重要，因为许多地方的育种家仍然严重依赖表型选择。MAS的一个主要限制是检测调控所需性状的QTL，以及标记之间发生双交换的可能性，这可能导致目标QTL丢失。使用MAS过程研究QTL是一项非常繁琐的工作，因为它具有累积效应，可能受环境条件和遗传构成控制。

基因组测序

生物生命周期的每个阶段都受其DNA构成的调控。为了解作物的可遗传性状，理解其基因组对于将基因组变异与所需农艺性状相关联至关重要，这有助于作物改良计划。此外，全基因组测序提供与植物生理学相关的信息，加速育种活动的遗传多样性，并有助于检测群体中的遗传变异，这在植物的生态和环境研究中变得有效。基因组测序是确定基因编辑性质和位点的关键方法，它为创新气候适应性作物品种以确保可持续生产打开了大门。桑格测序方法最初用于基因组测序，被称为第一代测序。由于成本高、通量低和劳动强度大等几个缺点，下一代测序（NGS）技术，也称为第二代测序，被发现。先进的基因组测序方法可以生成巨量数据，可用于识别重要的农艺性状，例如果实大小和颜色、开花时间、作物质量管理等。通过NGS可以获得全基因组测序，这些序列数据不仅有助于研究基因水平的变异，还有助于确定作物植物之间的进化关系。NGS产生大量基因组数据，有助于研究植物中的复杂性状，如耐盐性。使用NGS技术已成为可能高质量作图和候选基因检测。NGS遵循两种方法：合成测序和连接测序，通过NGS平台进行，如454焦磷酸测序、Illumina Solexa、Ion Torrent和ABI SOLiD测序。其中，Illumina和SOLiD平台在成本节约方面是赢家，因为它们每兆碱基（Mb）序列的成本低。然而，值得一提的是，没有一个平台能够同时满足用户的所有需求。

基因组测序通过识别蛋白质编码和非蛋白质编码区域，已成功用于作物育种计划，并作为作图和基因组学研究的基本工具。通过基因组测序技术的进步，开发气候适应性品种，包括水稻、油籽和豆类、水果和园艺作物，已成为可能，这些品种能够承受生物和非生物胁迫。

RNA干扰（RNAi）在植物中靶向基因的作用

农业生产力受到生物胁迫的严重影响，如昆虫、线虫、寄生杂草和病原体，包括病毒、细菌和真菌，这些对作物产量构成主要威胁，其中病毒和害虫对植物生产力的损失尤为严重。传统育种方法提高了作物的质量和产量，并开发了抗病和耐胁迫品种；然而，这些方法耗时、劳动密集，且受到许多作物遗传资源有限的限制。为解决这些问题，必须整合现代育种技术、分子遗传学、重组DNA技术和生物技术方法，以种植具有增强抗病性和环境胁迫的高产作物品种。此外，新出现的能够克服抗性品种的新开发强毒微生物强调了迫切需要创新策略来对抗这些高度适应的作物害虫。为克服这些挑战，RNA沉默或RNA干扰（RNAi）技术发挥了至关重要的作用，因为它是一个生物过程，诱导“转录后基因沉默（PTGS）”，由“双链RNA（dsRNA）”分子触发，以抑制特定靶基因的表达。RNAi技术已成功用于增强一系列理想性状，包括减少有毒或过敏化合物、诱导形态变化、修饰雄性不育和自交不亲和性、增强胁迫条件下次级代谢产物的生产以及提高植物对各种非生物胁迫的恢复力。

RNA干扰（RNAi）用于非生物胁迫耐受性

非生物胁迫对生物体已成为一个严重问题。非生物胁迫通过直接或间接破坏生理和发育过程，对植物生长和发育产生不利影响。相当一部分农业土地受到非生物胁迫的影响，这些胁迫可以显著降低作物生产力和产量。旨在增强作物植物非生物胁迫耐受性的传统育种方法迄今仅取得有限成功。同时，RNAi提供了一种精确的方法，用于靶向下调特定基因而不干扰植物中无关基因的表达。因此，该技术在为研究人员开辟新途径以应对全球环境挑战和开发气候适应性作物品种以确保粮食安全方面发挥着至关重要的作用。

RNA干扰（RNAi）用于生物胁迫耐受性

随着时间的推移，传统育种家已经开发出许多抗病和抗虫作物品种，但这种方法耗时、繁琐且复杂。使用农药或杀虫剂不仅对人类健康有害，而且对环境产生不利影响。研究人员采用了各种策略来开发病原体抗性品种，但在过去十年中，RNA干扰（RNAi）诱导的基因沉默已成为设计病原体抗性植物的有希望且有效的工具。这种方法通过能够靶向抑制胁迫诱导基因和促进与抗病性相关基因的表达，为植物改良铺平了环保策略的道路。

转基因方法

使用基因工程技术修改其DNA的植物称为转基因植物。这种修饰的目的是引入该植物物种中自然不存在的性状。这些植物包含一个或多个故意插入的基因。插入的基因，称为转基因，可能来自完全不同的物种或无关的植物。

最早的转基因植物是1982年开发的携带抗生素抗性的烟草植物。几年后，1986年，抗除草剂烟草植物在美国和法国进行了田间试验。在这些进展之后，Calgene于1994年推出了Flavr Savr?番茄，标志着第一个在工业化国家商业化生产和消费的转基因粮食作物。使用来自不同植物和细菌来源的遗传物质，通过根癌农杆菌介导的转化或其他直接转移DNA的技术，已成功将提供昆虫抗性、疾病保护和除草剂耐受性等性状的基因纳入作物。通常使用两种主要技术生产转基因作物：基因枪法，其中目标基因附着在金或钨微粒上，然后物理推进植物细胞，允许DNA整合到植物基因组中；根癌农杆菌方法，该方法使用一种自然能够将其DNA的一段（工程化携带所需基因）转移到宿主植物DNA中的细菌。

遗传转化已成为研究植物基因组的最重要技术之一。它现在广泛用于基因发现以及探索植物中基因的功能和调控机制。

将一组基因引入植物旨在增强其有用性和生产力。这种遗传修饰提供了几个好处，包括延长保质期、增加产量、更好的质量、抗虫性以及能够承受各种环境胁迫的能力，如极端温度、干旱和疾病。使用靶向基因或遗传构建体开发了一系列转基因植物，以改善性状，如抗病性和增加产量潜力。

高通量表型分析（HTP）

植物表型是在其生长和发育过程中通过其遗传组成与环境条件之间动态和复杂的相互作用建立的。传统育种家依赖人工表型分析，通过视觉检查、品尝和触摸来筛选作物性状，这耗时、劳动密集，通常具有破坏性，并且需要大量人力资源来评估大型作物群体。此外，常规表型分析技术在准确识别生化和生理性状方面面临挑战。为克服这一限制，多年来开发了各种表型分析平台，实现了更精确和全面的分析。高通量表型分析（HTP）集成了非破坏性和快速技术，可以快速表型分析大型植物群体并提高选择效率，以优化育种计划，开发改良品种。高通量表型分析（HTP）平台使用众多光学传感器记录植物特征的变化，包括生理、形态和生化变异。这些传感器对植物表面独特响应，并使用可见光（RGB）、高光谱、热、光检测和测距（LiDAR）以及荧光来监测和分析非破坏性性状。此外，将机器学习（ML）与人工智能（AI）相结合显著提高了表型分析数据的准确性和有效性。卷积神经网络（CNNs）是深度学习模型，在分类植物物种和预测生长阶段（包括拟南芥品系的鉴定）方面显示出卓越的准确性（高达99.92%）。VGG16、CNN和MobileNet模型利用深度学习技术准确识别一系列植物疾病。因此，将高通量表型分析与育种计划相结合有助于识别改良的农艺性状，这些性状可用于作物改良的未来进展。

诱变剂在分子育种中的作用

突变是指活细胞DNA中突然的、可遗传的改变，不是由遗传分离或重组引起的。突变育种是故意诱导和利用这种突变来开发改良作物品种。突变育种在作物改良中起着至关重要的作用，并补充了通过常规植物育种方法取得的进展。它是理解遗传现象的有效工具，如遗传进展、遗传力、基因型和表型的变异系数，以及诱变效率和有效性。作物改良突变育种的基础是在1920年代奠定的，当时John Stadler首次发现X射线对植物的诱变效应。1942年，首次报道了大麦中X射线诱导的抗病突变体。可以开发突变体品种以解决几乎所有的育种目标，包括产量、植物株高、质量、抗病和抗虫性、非生物胁迫耐受性、采后稳定性的改进以及引入新颖的消费者导向特征。

在突变育种中，直接暴露于诱变剂（物理或化学）的种子被称为M₀代，发芽后发育成M₁植物。随后，M₁代内发生自花授粉，产生的后代被称为M₂代。

诱变剂是物理（辐射）、化学和生物制剂，诱导DNA中不可逆的可遗传改变。诱变剂在突变育种中起着重要作用，因为特定诱变剂具有特定的诱变特性。它们通常分为两大类：物理和化学诱变剂。物理诱变剂进一步分为两个不同的组：电离辐射（例如伽马射线、X射线、离子束、中子、α和β粒子、质子）和非电离辐射（例如紫外线）。已经鉴定出一百多种化学诱变剂，分为几组，包括烷化剂、叠氮化物、吖啶染料、亚硝基化合物和碱基类似物。这些诱变剂显著加速植物育种计划，并且在开发气候适应性作物品种中具有影响力。

在过去的几十年里，突变育种经历了 significant advancements。迄今为止，在78个国家的251种植物物种中已经开发了超过3460个正式发布的突变品种。

分子技术在植物育种中的整合

在世界人口增加和前所未有的气候变化的背景下，对农业科学家来说，满足日益增长的粮食生产需求似乎非常具有挑战性。尽管传统植物育种方法具有一些优势，但显然，由于遗传力有限、遗传稳定性低、耗时和高成本等限制，这种植物育种方法 alone 将不足。考虑到这种情况，我们需要整合先进的分子育种方法，如基因组编辑、标记辅助选择（MAS）、高通量表型分析（HTP）等，以加速育种周期并确保精确选择育种材料。例如，通过标记辅助转移QTL，从FL478（一个耐盐系）转移Saltol到Pusa Basmati 1（PB1）在幼苗期表现出更高的耐盐性。通过将MAS整合到传统植物育种中，可以显著提高品种开发效率。基因组测序技术可以识别目标作物的变异，检测所需的农艺性状，并提供基因编辑的位点，从而与传统育种相比减少时间和成本。HTP技术的快速进步已经形成了从大量分离群体中识别耐胁迫基因型的能力，这有助于创新气候适应性作物品种。像CRISPR-Cas9这样的基因组编辑技术是最简单的方法来修改基因序列以开发非生物和生物胁迫耐受品种，以及改善作物的品质性状，如产量、营养品质等。转基因植物提供的众多优势极大地提高了作物恢复力和农业生产力。这些植物可以通过掺入来自其他生物的特定基因进行修饰，以表现出增强的抗虫、抗病和抗除草剂性。这减少了对化学投入的需求，并鼓励了环保的农业方法。RNA干扰（RNAi）在沉默特定基因表达和增强所需性状以开发耐胁迫作物品种方面至关重要。诱变剂对于产生遗传变异和识别与经济重要性状相关的关键调控序列以进行作物改良非常有效。总体而言，将分子技术纳入植物育种在时间