综述：滚环扩增技术在下一代分子诊断、基因组分析和空间转录组分析中的应用

本综述系统阐述了滚环扩增技术（RCA）作为革命性等温扩增平台在精准医疗领域的突破性应用。文章详述了其通过CRISPR整合、纳米颗粒信号放大等策略实现核酸/蛋白质/单细胞超敏检测（<10-18 M）的机制，重点分析了在染色体外环状DNA（eccDNA）测序和空间转录组（STP）原位测序中的核心价值，为肿瘤进化研究和细胞异质性解析提供了关键技术支撑。

　　

技术原理与演进

滚环扩增（Rolling Circle Amplification, RCA）是一种基于环状DNA模板和噬菌体DNA聚合酶的等温核酸扩增技术。其核心机制是通过引物与环状模板的特异性结合，在Φ29 DNA聚合酶作用下实现沿环状模板的持续复制，生成包含数十至数百个重复单元的长链DNA产物。这种独特的扩增方式使其具备单分子级灵敏度、超高扩增效率（10⁹倍扩增）和卓越序列保真度等优势。近年来发展出的固相RCA、水凝胶RCA和数字RCA等技术变体，进一步拓展了其在复杂生物样本中的适用性。

分子诊断创新应用

RCA技术与CRISPR-Cas系统、功能化纳米材料及微流控芯片的融合，推动了下一代分子诊断平台的革新：

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  通过将Cas12a/crRNA复合物与RCA产物结合，实现核酸检测灵敏度提升至阿摩尔级别（aM）

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  金纳米粒子（AuNPs）与RCA联用的比色生物传感器，可在30分钟内完成miRNA-21等癌症标志物的可视化检测

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  针对细胞外囊泡（EVs）表面蛋白的双重RCA策略，实现对肝癌源性外泌体的精准分型

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  数字RCA（dRCA）芯片技术成功实现单细胞水平mRNA绝对定量，为液体活检提供新方案

基因组分析突破

在基因组研究领域，RCA技术为解决染色体外环状DNA（extrachromosomal circular DNA, eccDNA）的研究难题提供关键技术支撑：

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  基于RCA的eccDNA富集测序方案（RCA-eccSeq）显著提升癌基因扩增子（如MYC、EGFR）的检出效率

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  成功解析肿瘤细胞中eccDNA介导的基因组不稳定性机制

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  揭示eccDNA在化疗耐药性形成中的动态演化规律

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  为癌症进化生物学研究提供单分子分辨率的研究工具

空间转录组解析

RCA技术在空间转录组学（Spatial Transcriptome Profiling, STP）领域展现出独特价值：

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  RCA驱动的原位RNA测序（RCA-in situ sequencing）实现组织切片中500+基因的同步定量定位

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  通过编码型RCA探针（barcoded RCA probes）技术，将空间分辨率提升至亚细胞级别（<1μm）

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  成功绘制乳腺癌微环境中免疫细胞空间分布图谱

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  揭示阿尔茨海默病脑中淀粉样斑块周边神经胶质细胞的转录组特征

挑战与展望

尽管RCA技术取得显著进展，仍面临反应特异性控制、自动化集成和临床转化成本等挑战。未来发展方向包括：

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  开发常温稳定的RCA冻干制剂用于床旁检测（POCT）

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  构建RCA与三代测序（Nanopore/PacBio）的联用平台

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  推进在单细胞多组学（scMulti-omics）中的整合应用

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  探索在微生物组快速诊断中的实施路径

通过持续的技术优化和跨学科融合，RCA技术有望成为精准医疗时代的核心分子诊断工具，为疾病早期诊断、动态监测和个性化治疗提供强大技术支撑。