CRISPR工程化人类GATA2缺陷模型揭示造血干细胞有丝分裂功能障碍与早衰机制

本研究针对GATA2单基因转录病（表现为骨髓衰竭、免疫缺陷及高白血病风险）的发病机制难题，通过CRISPR/Cas9技术在脐带血CD34+细胞中构建GATA2-R398W突变模型，结合SETBP1/ASXL1突变模拟恶性前阶段。研究发现GATA2缺陷导致造血干细胞（HSPC）有丝分裂异常、细胞周期阻滞及早衰表型，即使伴随致癌突变仍无法逆转其功能劣势。该模型为解析GATA2变异生物学效应及开发靶向疗法提供了重要平台，成果发表于《Leukemia》。

　　

背景与挑战

GATA2作为造血干细胞（HSPC）的关键转录因子，其杂合突变会导致骨髓衰竭、免疫缺陷及高达80%的白血病转化风险。尽管小鼠模型已揭示部分机制，但人类GATA2单倍剂量不足如何驱动疾病起始仍存空白。现有模型难以重现患者表型，而患者来源样本的异质性和获取难度进一步阻碍研究。

创新研究设计

西班牙研究团队Damia Romero-Moya等开发了新型人源化模型：通过CRISPR/Cas9在脐带血CD34⁺细胞中引入GATA2-R398W突变（锌指结构域常见致病突变），并联合SETBP1-D868N和ASXL1-G646Wfs*12突变模拟儿童MDS患者的分子特征。研究采用克隆竞争实验、连续移植和多功能组学分析，系统解析突变对造血功能的影响。

关键技术方法

1. 1.

   基于RNP（核糖核蛋白）的CRISPR/Cas9基因编辑联合rAAV6模板递送，实现GATA2/SETBP1/ASXL1多位点修饰

2. 2.

   NSG小鼠移植模型评估体内造血重建能力

3. 3.

   高分辨率显微镜定量有丝分裂缺陷（分析>5万细胞）

4. 4.

   RNA-seq与ATAC-seq整合分析转录组和染色质可及性变化

主要研究发现

1. 多重基因编辑实现人类造血干细胞改造

通过优化电转条件，在CD34⁺细胞中实现GATA2-R398W（GFP标记）与SETBP1/ASXL1的同步编辑，移植后16周仍维持>20%骨髓嵌合率。单克隆测序证实多基因突变共存，为模拟疾病演进提供基础。

2. GATA2突变细胞存在竞争性劣势

在野生型细胞共存环境下，GATA2-R398W细胞在移植4个月内逐渐消失，即使伴随SETBP1/ASXL1突变也无法逆转。二次移植后仅SETBP1/ASXL1双突变克隆显著扩增，证实GATA2缺陷的细胞自主性功能障碍。

3. 有丝分裂紊乱与增殖缺陷

GATA2突变细胞呈现染色体桥、纺锤体多极化等异常（发生率2倍于对照），伴随CD34⁺细胞比例下降（p<0.001）。转录组显示中心体相关基因（CEP68、STARD9）下调，提示GATA2可能通过维持有丝分裂保真度影响HSPC稳态。

4. 早衰样表型的分子特征

突变细胞上调衰老标志物CDKN2A/p16（4.5倍）和CLU（簇集蛋白），同时端粒酶（TERT）及其调控因子HMGA2/HMGB3表达降低。ATAC-seq显示衰老相关区域染色质开放，与患者CD34⁺细胞的GATA2-Down特征高度吻合。

5. 突变等位基因特异性表达

RNA-seq揭示R398W突变体mRNA表达量显著高于野生型等位基因（2.5倍），可能通过显性负效应加剧表型。这与小鼠模型中突变GATA2蛋白剂量依赖的毒性现象一致。

结论与意义

该研究首次在人类原代造血干细胞中证实：GATA2-R398W通过破坏有丝分裂保真度和激活衰老程序，导致HSPC功能耗竭。这种缺陷无法被SETBP1/ASXL1等继发突变完全代偿，为临床观察到的GATA2携带者造血储备降低提供机制解释。建立的CRISPR工程化模型不仅能精准模拟疾病不同阶段，其揭示的TERT下调、端粒缩短等新机制，为开发延缓造血衰竭的干预策略（如端粒酶激活剂）指明方向。研究还提示基因校正治疗可能赋予修正细胞选择性优势，为根治性疗法设计提供理论依据。