综述：转座子相关TnpB系统在细菌中的应用：耐辐射奇球菌

这篇综述系统阐述了耐辐射奇球菌(D. radiodurans)中TnpB蛋白作为CRISPR-Cas12f核酸酶进化前体的分子特征，揭示了其RNA引导的DNA切割机制（ωRNA/TAM依赖）在基因编辑领域的应用潜力，并对比分析了CRISPR-Cas系统（特别是微型Cas12f）与TnpB在结构域、作用机制和编辑效率等方面的异同。

　　

1 引言

耐辐射奇球菌(D. radiodurans)是地球上已知辐射抗性最强的生物之一，能耐受15 kGy的γ射线辐射，其卓越的生存能力源于多层次的防御机制：独特的六层细胞壁结构可阻挡辐射；紧凑的环状染色体能防止DNA碎片扩散；完善的修复系统包括五种DNA修复途径；强大的抗氧化体系能清除辐射产生的活性氧(ROS)。这些特性使其成为研究极端环境适应和基因编辑工具的宝贵资源。

该菌的ISDra2转座子编码的TnpB蛋白被证实具有RNA引导的核酸内切酶活性，能特异性切割5'-TTGAT转座子相关基序(TAM)相邻的DNA。进化分析表明，TnpB是广泛应用的CRISPR-Cas12核酸酶的功能祖先，两者共享保守的RuvC结构域。这类由转座子编码的蛋白被统称为"必须移动元件引导活性"(OMEGA)系统，其引导RNA称为ωRNA，为开发新型微型基因编辑工具提供了可能。

2 CRISPR/Cas系统概述

CRISPR-Cas是细菌和古菌的"获得性免疫系统"，通过crRNA引导Cas蛋白靶向切割外源DNA。根据效应复合物结构可分为两大类：I类(含多亚基复合物)和II类(单效应蛋白)。其中II类中的Cas12f（原称Cas14）是目前已知最小的RNA引导核酸酶（仅400-700个氨基酸），其独特之处在于：

1. 1.

   依赖双RNA引导（crRNA-tracrRNA复合物）

2. 2.

   识别TTTR(R=A/G)的原间隔序列邻近基序(PAM)

3. 3.

   切割后产生不对称粘性末端

4. 4.

   在45-55°C时表现出最佳活性

3 微型核酸酶Cas12f及其应用

Cas12f的防御过程分为三个阶段：适应（外源DNA片段整合至CRISPR阵列）、表达（pre-crRNA转录加工）和干扰（靶DNA切割）。结构研究表明，Cas12f通过二聚化结合sgRNA，其不对称切割模式源于独特的动态机制：先解开DNA并在非靶链(NTS)制造切口，随后外切酶活性扩展至间隔区外5bp，最终在靶链(TS)产生三个断裂位点。

工程化改造使Un1Cas12f1在哺乳动物细胞中实现高效编辑（效率媲美SpCas9），其微小体积更易通过腺相关病毒(AAV)递送。应用领域包括：

• •

  细菌检测：Cas14a-DETECTR平台可区分人类HERC2基因单核苷酸多态性(SNP)

• •

  环境监测：结合HUDSON方法实现人博卡病毒(HBoV1)快速检测

• •

  毒素筛查：基于Cas14-pMOFs荧光传感器可检测19 pg/mL的微囊藻毒素(MC-LR)

4 TnpB与CRISPR-Cas的进化关系

IS200/IS605转座子家族编码的TnpB蛋白被认为是Cas12的进化前体，两者关键区别在于：

1. 1.

   引导系统：TnpB使用转座子右末端衍生的ωRNA（约150 nt含假结结构），Cas12f需双RNA引导

2. 2.

   识别基序：TnpB切割TTGAT等TAM序列，Cas12f识别PAM

3. 3.

   结构形式：TnpB以单体发挥作用，Cas12f形成二聚体

作用机制上，TnpB遵循"剥离-粘贴-复制"模型：转座酶TnpA介导转座子移位后，TnpB通过ωRNA识别原插入位点的TAM并诱导双链断裂(DSB)，触发同源定向修复将转座子"归位"。冷冻电镜结构显示，ISDra2 TnpB的ωRNA假结结构与Cas12的sgRNA保守特征高度相似，证实其作为Cas12家族最小功能核心的地位。

5 TnpB的应用前景

经工程改造的TnpB系统展现出独特优势：

1. 1.

   超小体积：截短版ISDra2-TnpB仅379个氨基酸，更易AAV递送

2. 2.

   灵活识别：嗜热古菌SisTnpB1可识别5'-WNHNN-3'弱TAM变体

3. 3.

   高特异性：在小鼠肝脏编辑效率达75.3%，全基因组测序未检出脱靶

应用案例包括：

• •

  疾病治疗：在酪氨酸血症小鼠模型中成功校正致病突变

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  植物育种：ISYmu1 TnpB在水稻中实现高效编辑

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  检测技术：结合AI模型使编辑活性提升4.4倍

当前局限主要在于TAM序列限制和真核编辑效率不足（0-20%）。未来可通过定向进化扩展TAM兼容性、优化核定位信号、开发TnpB-脱氨酶融合体等策略改进。随着ωRNA设计优化和递送系统完善，这种源于极端微生物的纳米级工具将为基因治疗开辟新途径。

6 展望

耐辐射奇球菌中TnpB系统的发现，为理解CRISPR-Cas的进化提供了重要线索。相较于传统CRISPR系统，TnpB更小的体积和独特的ωRNA引导机制，使其在体内基因治疗中具有独特优势。通过深度挖掘微生物基因组资源、结合AI辅助设计，有望开发出比现有Cas系统更精准、更易递送的新型编辑工具，推动遗传病治疗和环境生物修复等领域的发展。