RyR2 S5与S6区段CPVT1点突变对钙信号传导的影响及其致心律失常机制研究

本研究针对心脏兰尼碱受体2（RyR2）S5-S6跨膜区段突变R4822H和L4865V，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建人诱导多能干细胞源性心肌细胞（hiPSC-CMs）模型，通过TIRF成像和全细胞膜片钳技术发现R4822H突变完全抑制钙诱导钙释放（CICR）但保留自发性搏动，而L4865V突变虽未显著影响CICR却引发心律失常，揭示了S5-S6区突变通过重塑钙信号通路导致表型分化的新机制，为CPVT1的精准治疗提供新靶点。

　　

心脏的规律收缩依赖于精确的钙离子信号传导，其中钙诱导钙释放（CICR）机制是核心环节：动作电位期间少量钙离子通过L型钙通道（Cav1.2）内流，触发肌浆网（SR）通过兰尼碱受体2（RyR2）释放大量钙离子，从而激活收缩蛋白。然而，RyR2的点突变常导致异常钙释放，引发儿茶酚胺敏感性多形性室性心动过速（CPVT1），这是一种常致命的心律失常疾病。尽管已有超过200个CPVT1相关突变被报道，但位于RyR2 S5-S6跨膜区段的突变如何影响钙信号传导仍缺乏系统研究。

为了深入解析S5-S6区突变的分子机制，研究团队选取了两个临床鉴定的CPVT1相关突变——位于S5-S6胞外环邻近离子选择滤器的R4822H和位于S6段的L4865V，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术将其引入人诱导多能干细胞（hiPSCs），并分化为心肌细胞（hiPSC-CMs）作为研究模型。研究采用全细胞膜片钳技术记录L型钙电流（I_Ca），结合TIRF成像同步监测胞质钙瞬变（Fura-2信号）和肌浆网钙释放（ER-GCaMP6信号），并分析自发钙火花特性。

3.1. 突变细胞系的构建与验证

通过CRISPR/Cas9技术成功获得R4822H纯合突变和L4865V杂合突变细胞系，RT-PCR和测序验证突变位点准确引入且RyR2 mRNA表达水平与野生型无显著差异。

3.2. 钙电流与触发钙释放的特征

野生型与突变细胞的I_Ca电流密度无显著差异，但R4822H突变细胞在去极化脉冲和尾电流触发下均显示胞质钙瞬变和SR钙释放显著抑制，而L4865V突变细胞仅表现为钙瞬变动力学轻微改变。ER-GCaMP6信号明确显示R4822H突变完全丧失I_Ca触发SR钙释放能力。

3.3. 咖啡因与4-CmC应答测试

20mM咖啡因或5mM 4-CmC在野生型和L4865V细胞中均可引发强烈SR钙释放及NCX电流（I_NCX），但R4822H突变细胞对两种激动剂均无响应，证实其SR钙释放功能严重受损。

3.4. 自发钙火花的特性

突变细胞自发钙火花频率与野生型相近，但R4822H和L4865V火花的持续时间显著缩短（分别降至32ms和46ms，野生型为58ms），振幅无差异，提示突变影响钙释放动力学而非触发机制。

3.5. 自发性搏动与心律失常表型

尽管R4822H突变完全抑制CICR，但细胞仍保持自发性搏动，且33%的细胞表现为心律失常性钙瞬变；L4865V细胞虽保留正常SR钙释放，但部分细胞出现不规则搏动。值得注意的是，R4822H突变细胞的搏动仅伴随Fura-2信号而无ER-GCaMP6信号，表明其钙瞬变源自CICR以外的替代通路。

本研究首次在人类心肌细胞模型中揭示S5-S6区突变R4822H通过破坏离子选择滤器功能完全抑制CICR，而S6区突变L4865V虽保留CICR但仍致心律失常。特别重要的是，R4822H突变细胞通过钙信号通路重塑（可能涉及IP3受体或线粒体钙循环）维持自发性搏动，这解释了患者何以在CICR缺失条件下存活。该发现不仅深化了对CPVT1异质性机制的理解，也为靶向特定突变类型的个性化治疗提供了实验依据。论文发表于《Cell Calcium》，为心脏钙信号领域提供了关键数据支撑。