生长素通过调控染色质可及性及再生进程显著提升植物基因编辑效率

本研究针对CRISPR/Cas9基因编辑在作物应用中效率低、嵌合体多、再生困难等瓶颈问题，创新性地发现适度提高外源生长素(auxin)浓度可通过调控染色质可及性(chromatin accessibility)和延缓植物再生进程双重机制显著提升T0代功能性编辑植株获得率。通过RNA-Seq、ATAC-Seq和组学分析揭示auxin通过下调组蛋白基因表达、激活组蛋白修饰酶基因，诱导染色质松弛从而增强Cas9可及性；同时建立"两阶段培养法"成功在番茄中验证普适性。该研究为克服多倍体及无性繁殖作物基因编辑难题提供了理论依据和技术方案，对加速作物精准育种进程具有重要科学价值。

　　

在作物遗传改良领域，CRISPR/Cas9基因编辑技术的出现带来了革命性的突破，它能够实现精准的基因敲除、碱基替换和小片段插入缺失等操作，且通常不需要引入外源基因，从而获得非转基因产品。然而，该技术在应用过程中仍面临诸多挑战：编辑效率在不同植物物种间差异显著，一些物种如菊花(Chrysanthemum morifolium)经常出现嵌合编辑事件，导致遗传不稳定和编辑效率低下；此外，大量T₀代编辑植株为杂合子，需要经过繁琐的后代分离筛选才能获得纯合突变体，这对于遗传背景复杂的多倍体植物和通过无性繁殖的作物尤为困难。

更深入的问题在于，真核生物的DNA在细胞核内以染色质形式存在，基因组DNA紧密缠绕在组蛋白上形成核小体，进一步折叠成复杂的空间结构。染色质的这种紧凑构型会动态变化，从闭合状态转变为开放状态，这一特性被称为染色质可及性(chromatin accessibility)，它对基因调控至关重要。研究表明，染色质的紧密程度直接影响CRISPR/Cas9的编辑效率——浓缩的异染色质区域会限制Cas9蛋白对DNA的接近，从而降低编辑效率；而开放的染色质区域则更易于发生编辑事件。

近年来，科学家们尝试通过各种策略提高基因编辑效率，包括扩展PAM识别序列、优化Cas9表达系统、使用多个gRNA同时编辑多个同源基因，以及通过纳米颗粒或病毒介导系统将CRISPR组分递送到植物生殖器官等。此外，还有研究通过过表达发育调控基因来增强体外植物再生能力，或通过注射携带发育调控基因的农杆菌来诱导直接芽再生。在提高染色质可及性方面，研究人员开发了Cas9-TV融合蛋白，将Cas9与合成转录激活结构域融合，增强靶位点的染色质可及性；还有研究使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACis)来增加染色质开放性，从而提高编辑效率。

然而，这些方法大多依赖于复杂的生物技术设计，操作繁琐且成本较高。有没有更简单、更通用的方法来提高植物基因编辑效率呢？近期研究发现，植物激素生长素(auxin)信号通过表观遗传机制调节染色质可及性，涉及组蛋白乙酰化、组蛋白甲基化和核小体重塑等过程。auxin影响组蛋白乙酰转移酶(HATs)和组蛋白去乙酰化酶(HDACs)的活性，通过动态组蛋白乙酰化状态调控靶位点的转录能力。此外，auxin应答转录因子与共抑制因子相互作用，招募HDACs建立抑制性染色质环境。auxin还通过与多梳抑制复合物2(PRC2)的交叉对话影响组蛋白甲基化，在发育转换过程中动态调节H3K27me3水平。

基于这些前期研究，美国佛罗里达大学和西北农林大学的研究团队开展了一项创新性研究，探索了通过简单调节外源auxin浓度来提高植物基因编辑效率的可行性。他们发现，在体外组织培养过程中适度提高auxin浓度，能够显著提高功能性编辑植株在T₀代的产生效率，这主要通过增加染色质可及性和延缓植物再生进程两种机制实现。相关研究成果发表在《Horticulture Research》上，为加速基因编辑育种项目提供了新的见解和理论基础。

研究人员运用了多种关键技术方法开展本研究：采用农杆菌介导的遗传转化方法将CRISPR/Cas9系统导入烟草和番茄；使用不同浓度的萘乙酸(NAA)处理研究auxin对编辑效率的影响；通过石蜡切片和显微镜观察分析细胞和细胞核形态变化；应用RNA-Seq技术检测基因表达差异；采用ATAC-Seq(Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing)评估染色质可及性变化；通过Sanger测序验证编辑事件和脱靶效应；利用体外切割实验检测auxin对Cas9酶活性的直接影响。

Effects of NAA concentrations on plant regeneration in tobacco

研究人员首先研究了不同浓度NAA(0.1、0.3、0.5和0.7 mg/L)与2 mg/L 6-BA(6-苄基腺嘌呤)组合对烟草再生的影响。发现较低NAA浓度(0.1和0.3 mg/L)下，芽再生在接种后25天(dpi)即可见，而在较高NAA浓度(0.5和0.7 mg/L)下，只形成大量愈伤组织，无可见芽再生。到44 dpi时，所有处理组都观察到由NbPDS3基因编辑产生的白化芽；51 dpi时，大多数再生芽完全发育，但0.5和0.7 mg/L NAA组的愈伤组织明显更大。

Effects of NAA concentrations on gene editing efficiency in tobacco

以烟草PDS3基因为编辑靶点，该基因表达对叶绿体发育至关重要，其破坏会导致体外组织培养中再生芽出现不同程度白化。结果显示增加外源auxin显著提高了显示完全白化表型的芽频率：0.5 mg/L NAA处理产生最多白化突变体(15.18%)，是0.7 mg/L NAA组(5.95%)的2.6倍，是0.1 mg/L NAA组(6.41%)的2.4倍。PCR测序发现0.5 mg/L NAA处理中有更多缺失事件，特别是大片段缺失(>20bp)。使用单gRNA的实验也证实了较高auxin浓度能增强T₀代功能性编辑植株的产生。

Morphological and histological differences in tobacco callus cells

形态和组织学分析显示，0.5 mg/L NAA处理的愈伤组织细胞比0.1 mg/L NAA处理的大约2.5倍，细胞核大约3.1倍，且染色较浅，表明染色质去浓缩。这些差异在培养早期(25天)就已 detectable，并随着培养时间延长而更加明显。

Altered expression of genes related to chromatin remodeling and plant regeneration

RNA-seq分析发现，0.5 mg/L NAA处理在早期阶段显著改变了9,102个基因的表达，在完全生长阶段改变了2,603个基因。GO分析显示与染色体结构和染色质动力学相关的术语富集，如组蛋白基因(H2A.I/X-like、H3.1和H4)在两个阶段都显著下调，核小体组装和染色质浓缩相关基因在完全生长阶段下调。相反，组蛋白去甲基化/乙酰化相关基因在早期阶段上调。许多芽再生相关基因(WUS/WOX、PLT和GRF)在两个阶段都下调，这与0.5 mg/L NAA处理中芽形成延迟和减少相一致。

The effects of NAA concentrations on chromatin accessibility in tobacco cells

ATAC-Seq分析证实较高auxin水平(0.5 mg/L NAA)增加了烟草细胞的染色质可及性。尽管可及性增加，但可及染色质区域的分布模式在两种处理间相似，测序reads主要定位在基因间区，其次是启动子和内含子区域，外显子区域最少。对靶基因NbPDS3的ATAC-seq信号富集分析显示，0.5 mg/L NAA处理比0.1 mg/L NAA处理具有更高的染色质可及性。gRNA2靶向区域比gRNA1区域显示显著更高的染色质可及性，这与gRNA2位点更高的编辑频率相关。

Increased auxin concentration improved gene editing efficiency in tomato

将相同方法应用于番茄SIPDS同源基因敲除，发现番茄再生对auxin浓度变化耐受性较低。为此研究人员建立了"两阶段"培养策略：番茄子叶先在含有不同浓度NAA(50、150、300 μg/L)的愈伤组织诱导培养基上培养4周，然后转移到芽诱导培养基(20 μg/L NAA和0.5 mg/L ZT)促进芽再生。结果发现300μg/L NAA预处理组产生最多突变芽，总可见编辑效率达53.45%，显著高于50μg/L组的30.43%。

Detection of off-target gene-edited mutations

通过Sanger测序评估潜在脱靶效应，在烟草和番茄的预测脱靶位点均未检测到突变事件，表明在高auxin浓度下编辑特异性仍得以保持。

Detection of the effect of auxin on the Cas9 activity in vitro

体外切割实验显示，添加或不添加auxin处理，Cas9切割活性无差异，表明auxin不直接增强Cas9酶活性，而是通过调控细胞内环境提高编辑效率。

本研究揭示了auxin影响植物基因编辑效率的新机制：一方面，较高auxin浓度影响染色质状态，通过下调组蛋白基因表达、核小体组装和染色质浓缩相关基因，以及上调组蛋白修饰酶基因，使染色质结构更加松弛，增强基因组DNA对Cas9的可及性；另一方面，增加auxin浓度促进愈伤组织生长和延迟芽 initiation，为Cas9蛋白在去分化细胞快速分裂期间提供更长的作用时间窗口，从而间接提高基因编辑效率。

基于这一模型，研究人员开发的"两阶段"培养策略能够克服过量auxin应用对芽再生的抑制作用，可应用于多种植物物种加速基因编辑育种进程。这一发现对于具有长生长周期的多倍体物种育种尤其有价值， combined with 无转基因基因组编辑技术，能够解决遗传背景复杂和/或无性繁殖作物的关键挑战，在T₀代产生具有突变表型的基因编辑事件，避免了通过种子分离推进杂合突变的必要性，从而保留理想性状并促进无转基因突变体的获得。

该研究的创新之处在于发现了通过简单调节植物激素浓度这种相对简单的方法来提高基因编辑效率的新途径，不仅为增强植物基因编辑效率开辟了新途径，还突出了利用植物激素和发育过程优化基因编辑方法的潜力，对推进CRISPR技术在作物改良项目中的应用具有重要意义。未来研究需要进一步阐明auxin信号在组织培养过程中如何调节染色质状态的精确机制，以及这种方法在不同植物系统和基因编辑平台中的普适性。