基于哑铃形DNA拓扑结构的自持CRISPR/Cas12a指数扩增技术实现DNA甲基转移酶活性的超灵敏监测

本研究创新性地构建了一种基于哑铃形DNA拓扑结构（DDTS）的自持（自催化）CRISPR/Cas12a指数信号放大系统，实现了对DNA甲基转移酶（MTase）活性的超灵敏荧光检测。该系统通过拓扑结构精准调控Cas12a的激活机制，在Dam MTase作用下触发自催化循环，显著提升检测灵敏度（检测限达6.37×10?4 U/mL），兼具优异选择性及抑制剂筛选能力，为疾病早期诊断和药物发现提供了新策略。

　　

Highlight

本研究的创新亮点在于首次将哑铃形DNA拓扑结构与CRISPR/Cas12a系统耦合，构建了具有自持性指数放大功能的生物传感平台，为表观遗传调控研究提供了超灵敏工具。

Section snippets

Reagents and apparatus

实验所用氯化钠、氯化镁、Tris-HCl缓冲液及5-氟尿嘧啶购自国药集团化学试剂有限公司（上海）。Dam MTase、Dnmt1、M.SssI、MspI、S-腺苷甲硫氨酸（SAM）、DpnI内切酶、LbCas12a酶、T4 DNA连接酶、核酸外切酶I（Exo I）及核酸外切酶III（Exo III）均购自北京纽英伦生物技术有限公司。所有寡核苷酸链（HPLC纯化）由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列详见表1。

Preparation of the DDTS

将磷酸化DNA（6 μM）溶于Tris缓冲液（100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 50 mM Tris-HCl, pH 7.9）中，95℃加热5分钟后缓慢冷却至室温，加入T4 DNA连接酶（20 U）在16℃下反应12小时。通过12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化目标条带，最终产物于-20℃保存备用。

Detection strategy for Dam MTase activity

如Scheme 1所示，该自催化CRISPR/Cas12a指数放大系统的检测原理如下：哑铃形DNA拓扑结构（DDTS）包含三个关键模块：（1）Dam MTase识别位点（5′-GATC-3′，黑色标注）；（2）拓扑约束型双链DNA环（蓝色区域）；（3）环内两个单链DNA域（红色区域）。当Dam MTase不存在时，DDTS探针的拓扑环会空间阻碍crRNA与Cas12a复合物的结合，使系统保持静默状态。而存在Dam MTase时，探针中的GATC位点发生甲基化，随后被DpnI内切酶特异性切割，导致DDTS拓扑结构解离并生成线性双链DNA激活剂。这些激活剂可唤醒Cas12a的反式切割（trans-cleavage）能力，进而切割其他完整DDTS探针中的单链DNA域，释放出更多双链DNA激活剂，形成自催化指数放大循环。值得注意的是，DDTS的结构设计可避免溶液中探针的非特异性降解，其单链DNA域的切割不仅不会导致信号损失，反而会促进Cas12a的进一步激活。这种精准的自催化反应机制实现了背景抑制与信号增强的完美平衡。

Conclusion

总之，我们开发了一种基于自催化CRISPR/Cas12a指数放大系统的Dam MTase活性超灵敏监测技术。设计的DDTS探针有效解决了传统等温扩增-Cas12a联用系统中单链DNA探针易被反式切割的技术难题，同时建立了稳健的自催化反馈机制用于信号放大。该方法对Dam MTase的检测限低至6.37×10^?4 U/mL，线性范围为1×10^?3至15 U/mL，并展现出优于其他MTase和核酸酶的选择性。此外，该方法成功应用于抑制剂筛选，测得5-氟尿嘧啶的半抑制浓度（IC₅₀）为1.84 μM。因此，本平台在疾病早期诊断、细菌毒性评估及酶抑制剂筛选领域具有广阔应用前景。