抑制性tRNASUAG通过泛素-蛋白酶体途径降解HBc核心蛋白抑制乙型肝炎病毒复制

本研究发现，经反密码子工程改造的tRNA（ACE-tRNA）能特异性识别乙型肝炎病毒（HBV）核心蛋白（HBc）的高度保守终止密码子UAG，其中tRNASUAG通过引入可磷酸化丝氨酸，促进HBc经泛素-蛋白酶体（ubiquitin-proteasome）途径降解，从而显著抑制多种基因型HBV的复制。研究还创新性地构建了tRNASUAG-gRNA串联阵列，实现了与CRISPR/Cas9技术的协同抗病毒效果，为慢性乙型肝炎的治疗提供了新策略。

　　

引言

乙型肝炎病毒（HBV）感染仍是全球重大健康问题，约2.54亿人患有慢性HBV感染，每年约110万人死于HBV相关的终末期肝病，包括肝硬化和肝细胞癌。目前抗HBV药物，包括核苷（酸）类似物和聚乙二醇化干扰素α，在实现慢性乙型肝炎的功能性治愈方面仍面临挑战。因此，有必要探索新的治疗方法和联合治疗策略。

HBV核心蛋白（HBc）在HBV复制中起关键作用，并与严重肝炎的细胞病变效应相关，这使其成为HBV感染及相关肝病的有希望的治疗靶点。目前，针对HBc组装过程的衣壳组装调节剂（CAMs）已在临床试验中得到广泛探索。尽管CAMs能有效抑制HBV复制，但仍存在一定局限性，例如出现耐药HBV变异株导致病毒学突破，以及某些CAMs诱导的肝损伤导致丙氨酸转氨酶（ALT）水平升高。因此，有必要开发针对HBc的新方法，以降低毒性和耐药性。

反密码子工程改造的tRNA（ACE-tRNA）可通过修饰天然tRNA的反密码子环，特异性识别指定的终止密码子（UAA-赭石密码子、UAG-琥珀密码子或UGA-opal密码子）。ACE-tRNA能高效通读功能蛋白开放阅读框（ORF）内的提前终止密码子（PTC），并恢复全长蛋白的产生。然而，ACE-tRNA几乎不能通读天然终止密码子。因此，ACE-tRNA在治疗由无义突变引起的各种遗传性疾病方面具有广阔前景，例如β-地中海贫血、囊性纤维化和杜兴氏肌营养不良，并可通过腺相关病毒（AAV）或脂质纳米颗粒进行递送。

HBV基因组是部分双链DNA，约3.2 kb，包含四个重叠的ORF：C、P、S和X。C ORF中的HBc和P ORF中的HBV DNA聚合酶均从前基因组RNA（pgRNA）翻译而来。由于C和P ORF部分重叠，且C ORF正常终止密码子（UAG）后面另一个框内终止密码子（UAA）的存在，C ORF的正常终止密码子UAG在某些方面类似于PTC。因此，ACE-tRNA有可能通读C ORF的正常终止密码子，这可能成为治疗HBV感染的潜在方法。尽管ACE-tRNA已通过通读PTC广泛用于治疗各种遗传性疾病，但其在抗病毒治疗中的作用尚未见报道。

基于RNA链的二级结构而非特定核苷酸序列，tRNA的5'前导序列和3'拖尾序列在tRNA成熟过程中分别被RNase P和RNase Z切割。这一独特特性使tRNA能够作为串联表达多重非编码RNA的支架。对于成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关核酸酶9（Cas9）系统，tRNA-指导RNA（gRNA）串联阵列已成功在水稻、果蝇和酿酒酵母中实现多重gRNA的串联表达。然而，在哺乳动物细胞中关于tRNA-gRNA串联阵列的研究有限。

在本研究中，首先探索了ACE-tRNA是否能通读C ORF的终止密码子。然后，探讨了ACE-tRNA对HBV复制的影响及其潜在机制。此外，还探索了是否可以通过ACE-tRNA-gRNA串联阵列有效整合ACE-tRNA和CRISPR/Cas9技术，以实现对HBV复制的联合抑制。

结果

ACE-tRNA可通读C ORF的终止密码子

通过序列分析，发现C ORF的正常终止密码子是UAG且高度保守。在基因型B-D HBV基因组中，C ORF的UAG位于nt2450-2452，而在基因型A HBV基因组中，由于在nt2356-2361插入了六个核苷酸（GGACCG），UAG位于nt2456-2458。P ORF的终止密码子是UGA，S ORF的终止密码子是UAA或UGA，X ORF的终止密码子是UAA。因此，UAG是C ORF的特异性终止密码子。HBc在C ORF中，聚合酶在P ORF中，均从pgRNA翻译而来。P ORF位于C ORF后面，并与C ORF部分重叠。此外，另一个高度保守的框内终止密码子UAA位于UAG后面，两个终止密码子之间有五个密码子，这使得C ORF的正常终止密码子在某些方面类似于PTC。因此，ACE-tRNA有可能通读C ORF的UAG。

基于Lueck对ACE-tRNA通读效率的高通量筛选，选择了针对UAG的前三种ACE-tRNA，分别命名为tRNA^SUAG、tRNA^LUAG和tRNA^QUAG，它们分别来源于携带丝氨酸（S）、亮氨酸（L）和谷氨酰胺（Q）的天然tRNA。为了评估三种ACE-tRNA的通读效率，构建了一个包含PTC的萤火虫荧光素酶（Fluc）报告基因，通过在Fluc的酰基激活酶共识基序上游插入TAG。PTC通过提前终止其翻译有效阻断了Fluc的催化活性。一旦ACE-tRNA成功通读PTC，将翻译出全长Fluc。结果显示，三种ACE-tRNA均能通读Fluc报告基因中的PTC，且tRNA^SUAG的通读效率最高。

为了进一步探索ACE-tRNA是否能通读C ORF的UAG，构建了一个HBc-Nano荧光素酶（Nluc）报告基因，通过在C ORF的UAG后面插入Nluc ORF，并构建了能够通过CMV启动子同时表达Fluc的ACE-tRNA表达质粒。一旦ACE-tRNA通读C ORF的UAG，Nluc将被翻译。结果显示，三种ACE-tRNA均能通读C ORF的UAG，在排除由Fluc活性反映的转染效率差异后，tRNA^QUAG的通读效率似乎最高。尽管由tRNA^QUAG诱导的flag-HBc-Nluc融合蛋白水平最高且与Nluc活性一致，但由tRNA^SUAG诱导的flag-HBc蛋白水平最低。为了进一步确认ACE-tRNAs对HBc水平的影响，构建了一个flag-HBc表达质粒，能够通过EF-1α启动子同时表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）。结果显示，在排除由Fluc活性和EGFP水平反映的转染效率差异后，tRNA^SUAG显著降低了HBc蛋白水平，而其他两种ACE-tRNA则没有。此外，tRNA^SUAG以剂量依赖性方式降低HBc蛋白水平。这些结果表明，ACE-tRNAs能以不同效率通读C ORF的终止密码子，而只有tRNA^SUAG能降低HBc蛋白水平。

tRNA^SUAG通过降低HBc水平抑制HBV复制

接下来发现，在排除由Fluc活性反映的转染效率差异后，只有tRNA^SUAG通过降低HBc、乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎e抗原（HBeAg）和HBV DNA的水平显著抑制基因型C HBV复制。通过tRNA^SUAG特异性逆转录（RT）-定量聚合酶链反应（qPCR）分析评估tRNA^SUAG的转染效率后，进一步通过Northern blotting和Southern blotting分析证实tRNA^SUAG显著抑制HBV复制。为了确认tRNA^SUAG是否通过通读HBc的终止密码子UAG抑制HBV复制，构建了一个基因型C 1.3×HBV G2452A突变质粒，其中HBc的终止密码子从UAG突变为UAA。当HBc的终止密码子从UAG突变为UAA时，tRNA^SUAG介导的HBc蛋白水平下降及其对HBV复制的抑制作用消失，表明tRNA^SUAG通过通读HBc的终止密码子UAG降低HBc蛋白水平并抑制HBV复制。进一步发现，紧接在HBc终止密码子UAG后面的核苷酸是U，且在C ORF中高度保守。考虑到紧接在终止密码子后面的核苷酸对终止效率有很大影响，构建了一个Fluc-HBc上下文-Nluc报告基因，其中包含HBc的终止密码子UAG以及上游和下游各九个核苷酸。除了野生型上下文外，紧接在终止密码子后面的核苷酸还分别突变为A、G和C。检测了具有不同上下文的HBc终止密码子UAG的通读效率，结果显示，与UAGA、UAGG和UAGC相比，UAGU最容易被tRNA^SUAG通读。为了探索tRNA^SUAG是否通过降低HBc水平抑制HBV复制，根据潜在的HBc翻译起始位点，通过在C2起始密码子后面引入提前终止密码子UAA，构建了一个带有HBc无义突变的基因型C 1.3×HBV质粒（HBV△HBc）。当HBc表达被阻断时，tRNA^SUAG抑制HBV复制的作用消失。还构建了一个带有UAA终止密码子的HBc表达质粒（HBc-UAA），发现过表达HBc-UAA挽救了tRNA^SUAG对HBV复制的抑制作用。这些结果表明，tRNA^SUAG通过降低HBc水平抑制HBV复制。此外，tRNA^SUAG还通过降低HBc水平显著抑制基因型A或B HBV复制。

接下来，使用慢病毒表达系统，在HepAD38细胞中建立了稳定表达tRNA^SUAG的HepAD38-tRNA^SUAG细胞，条件性产生基因型D HBV。通过HBc-Nluc报告基因证实了tRNA^SUAG在HepAD38-tRNA^SUAG细胞中的表达。与其他基因型一致，tRNA^SUAG还通过降低HBc水平显著抑制基因型D HBV复制，且不引起细胞毒性。

tRNA^SUAG在HBV感染细胞模型中抑制HBV复制

为了探索tRNA^SUAG在HBV感染下对复制的影响，构建了在HepG2-NTCP细胞中稳定表达tRNA^SUAG的HepG2-NTCP-tRNA^SUAG细胞及其阴性对照HepG2-NTCP-NC细胞。通过HBc-Nluc报告基因证实了tRNA^SUAG在HepG2-NTCP-tRNA^SUAG细胞中的表达。同时，在HepG2-NTCP-tRNA^SUAG细胞中未发现细胞毒性。HepG2-NTCP-NC和HepG2-NTCP-tRNA^SUAG细胞用HepAD38细胞产生的HBV以500基因组当量每细胞（500 geq/cell）感染，并在感染后7天检测tRNA^SUAG对HBV复制的影响。结果显示，tRNA^SUAG还在HBV感染的HepG2-NTCP-tRNA^SUAG细胞中通过降低HBc水平显著抑制HBV复制。

为了排除tRNA^SUAG诱导的对人类基因正常终止密码子UAG的非特异性通读可能造成的干扰，在HepG2-NTCP-NC和HepG2-NTCP-tRNA^SUAG细胞中进行了核糖体分析（Ribo-seq）分析。每个丝氨酸密码子的占用率未受tRNA^SUAG显著影响，表明tRNA^SUAG未显著影响tRNA稳态。映射到带有终止密码子UAG的mRNA的3'非翻译区（UTR）的核糖体保护mRNA片段（RPF）的丰度在两种细胞中相当，表明tRNA^SUAG诱导的对天然终止密码子UAG的非特异性通读率与近同源tRNA诱导的生理通读率相当。进一步，计算了所有带有终止密码子UAA、UAG或UGA的mRNA的核糖体通读评分（RRTS）值。结果显示，tRNA^SUAG未在所有天然终止密码子处引起显著通读。此外，定量蛋白质组学分析也证实tRNA^SUAG难以通读人类基因的正常终止密码子UAG，且没有富集具有潜在细胞毒性的通路。

tRNA^SUAG在体内抑制HBV复制

为了探索tRNA^SUAG对体内HBV复制的影响，包装了携带tRNA^SUAG的AAV血清型8（AAV8）和AAV8-1.3×HBV（基因型D），并同时注射到C57BL/6J小鼠的尾静脉中以避免免疫干扰。每组有七只小鼠，每组三只小鼠在注射后4周处死，每组另外四只小鼠在注射后12周处死。结果显示，tRNA^SUAG通过持续降低小鼠中HBc、HBsAg、HBeAg和HBV DNA的水平显著抑制HBV复制，表明tRNA^SUAG随时间保持功能完整性。一致地，证实了小鼠肝组织中tRNA^SUAG的表达水平在注射后12周保持稳定。两组小鼠的体重没有显著差异，通过组织学检查和临床血清生化分析未发现小鼠组织有明显炎症或损伤，表明tRNA^SUAG在体内未引起显著细胞毒性。同时，每个丝氨酸密码子的占用率未受tRNA^SUAG显著影响，表明tRNA^SUAG未显著影响体内tRNA稳态。映射到带有终止密码子UAG的mRNA的3' UTR的RPF丰度在两组小鼠中相当，表明tRNA^SUAG诱导的对天然终止密码子UAG的全局非特异性通读率也与近同源tRNA诱导的小鼠基因生理通读率相当。与天然终止密码子UAG一致，tRNA^SUAG也未在天然终止密码子UAA和UGA处引起显著通读。

tRNA^SUAG通过引入可磷酸化丝氨酸促进HBc降解

为了探索tRNA^SUAG介导的HBc水平降低的机制，通过将UAG突变为编码丝氨酸的密码子AGC，构建了一个tRNA^SUAG诱导的更长HBc（L-HBc）表达质粒。L-HBc的蛋白水平显著低于野生型HBc，这与tRNA^SUAG介导的HBc水平降低一致。值得注意的是，观察到L-HBc的两个条带：较弱条带的迁移率与野生型HBc相同，而较强条带的迁移率低于野生型HBc。同时，通过增加上样量和延长曝光时间，还在共转染flag-HBc和tRNA^SUAG表达质粒的HepG2细胞中观察到相同的HBc两个条带，这进一步证实tRNA^SUAG可通过通读HBc的终止密码子诱导L-HBc的产生。由于L-HBc仅比野生型HBc长六个氨基酸，不足以引起迁移率的显著变化，表明某些翻译后修饰可能导致L-HBc的迁移率较低。

L-HBc的稳定性显著低于野生型HBc。据报道，HBc通过泛素-蛋白酶体和溶酶体依赖途径降解。为了揭示L-HBc降解的机制，用MG132（一种蛋白酶体抑制剂）或羟氯喹（HCQ，一种溶酶体抑制剂）处理转染pCDH-flag-HBc或pCDH-flag-L-HBc质粒的HepG2细胞。结果显示，L-HBc的水平通过用MG132处理恢复，但用HCQ处理则没有。与野生型HBc相比，L-HBc的泛素化水平增加，表明L-HBc主要通过泛素-蛋白酶体途径降解。为了探索L-HBc是否影响衣壳组装，通过天然琼脂糖凝胶电泳检测了由野生型HBc和L-HBc形成的衣壳水平。结果显示，由野生型HBc和L-HBc形成的衣壳的相对水平相当，但由L-HBc形成的衣壳大小大于野生型HBc，这可能是因为L-HBc比野生型HBc长。

据报道，HBc的翻译后修饰，尤其是C末端结构域（CTD）中的磷酸化，可以调节HBc的稳定性和功能。tRNA^SUAG引入的丝氨酸是一种可磷酸化氨基酸。因此，通过LC-MS分析了野生型HBc和L-HBc的磷酸化状态，以进一步阐明tRNA^SUAG介导的HBc降解机制。对于HBc的已知磷酸化位点，野生型HBc和L-HBc的磷酸化水平相当，而tRNA^SUAG引入的丝氨酸（S184）和相邻丝氨酸（S181）在L-HBc中被磷酸化。为了探索磷酸化的S181和S184是否介导L-HBc降解，将S181和S184单独或组合突变为不可磷酸化的丙氨酸（A），或将S184突变为不可磷酸化的谷氨酰胺（Q）。当S184突变为A或Q时，L-HBc的蛋白水平和迁移率恢复到与野生型HBc相当。此外，当S184突变为A时，L-HBc的泛素化水平也恢复到与野生型HBc相当，表明tRNA^SUAG引入的丝氨酸是导致HBc泛素-蛋白酶体降解的关键磷酸化位点。

tRNA^SUAG-gHBV串联阵列对HBV复制表现出联合抑制效果

为了开发基于ACE-tRNA的多靶点治疗策略，构建了一个（ACE-tRNA）-gRNA串联阵列，以整合ACE-tRNA与CRISPR/Cas9技术。通过将tRNA^SUAG与本课题组先前设计的HBV特异性gRNA（gHBV1和gHBV2）结合，构建了一个tRNA^SUAG-gHBV1-tRNA^SUAG-gHBV2-tRNA^SUAG串联阵列，其中tRNA^SUAG的亲本tRNA（tRNA^SAGC）、乱序gRNA1（gScr1）和乱序gRNA2（gScr2）分别用作tRNA^SUAG、gHBV1和gHBV2的阴性对照。首先证实了与tRNA^SAGC相比，tRNA^SUAG还能通过降低HBc显著抑制HBV复制。进一步发现，通过tRNA^SAGC-gHBV1-tRNA^SAGC-gHBV2-tRNA^SAGC和tRNA^SUAG-gHBV1-tRNA^SUAG-gHBV2-tRNA^SUAG串联阵列有效去除了gHBV1/Cas9和gHBV2/Cas9切割位点之间的DNA序列，并形成了缩短的HBV基因组，表明gHBV1和gHBV2可以从两个串联阵列中高效释放。与tRNA^SAGC-gScr1-tRNA^SAGC-gScr2-tRNA^SAGC串联阵列相比，tRNA^SAGC-gHBV1-tRNA^SAGC-gHBV2-tRNA^SAGC和tRNA^SUAG-gHBV1-tRNA^SUAG-gHBV2-tRNA^SUAG串联阵列显著抑制HBV复制，且tRNA^SUAG-gHBV1-tRNA^SUAG-gHBV2-tRNA^SUAG串联阵列抑制HBV复制的能力显著高于tRNA^SAGC-gHBV1-tRNA^SAGC-gHBV2-tRNA^SAGC串联阵列。

接下来，建立了在HepG2-NTCP细胞中稳定表达tRNA^SUAG-gHBV1-tRNA^SUAG-gHBV2-tRNA^SUAG串联阵列的HepG2-NTCP-tRNA^SUAG-gHBV1-tRNA^SUAG-gHBV2-tRNA^SUAG细胞，并通过HBc-Nluc报告基因证实。HepG2-NTCP-tRNA^SUAG-gHBV1-tRNA^SUAG-gHBV2-tRNA^SUAG和对照细胞用HepAD38细胞产生的HBV（500 geq/cell）感染，并在感染后7天检测tRNA^SUAG-gHBV1-tRNA^SUAG-gHBV2-tRNA^SUAG串联阵列对HBV复制的影响。结果显示，tRNA^SUAG-gHBV1-tRNA^SUAG-gHBV2-tRNA^SUAG串联阵列还能在HBV感染的HepG2-NTCP-tRNA^SUAG-gHBV1-tRNA^SUAG-gHBV2-tRNA^SUAG细胞中实现联合抑制HBV复制的效果，且无细胞毒性。

此外，使用流体动力注射（HDI）小鼠模型评估了tRNA^SUAG-gHBV串联阵列对HBV复制的影响。一致地，通过tRNA^SAGC-gHBV1-tRNA^SAGC-gHBV2-tRNA^SAGC和tRNA^SUAG-gHBV1-tRNA^SUAG-gHBV2-tRNA^SUAG串联阵列高效形成了缩短的HBV基因组，表明gHBV1和gHBV2也可以从两个串联阵列中高效释放体内。同时，tRNA^SUAG-gHBV1-tRNA^SUAG-gHBV2-tRNA^SUAG串联阵列还能在体内实现双靶点联合抑制HBV复制的效果，且无细胞毒性。

讨论

鉴于RNA疗法已广泛探索用于治疗各种疾病，ACE-tRNA的递送系统和稳定性增强修饰已得到充分支持。然而，ACE-tRNA的安全性对其临床应用仍然至关重要。由于3' UTR的结构、poly(A)结合蛋白以及围绕天然终止密码子的序列（包括四核苷酸信号）有助于防止对天然终止密码子的非特异性通读，ACE-tRNA诱导的天然终止密码子的非特异性通读率与近同源tRNA诱导的生理通读率一样低。在本研究中，通过Ribo-seq和定量蛋白质组学分析进一步证实ACE-tRNA难以通读人类基因的正常终止密码子，证明了ACE-tRNA的潜在安全性，并支持其未来的临床应用。为了进一步确保ACE-tRNA治疗HBV感染的安全性，可以采用肝脏特异性靶向策略，包括使用嗜肝性AAV8进行肝组织特异性递送，以及使用肝细胞特异性启动子控制ACE-tRNA表达。这些策略可以显著提高对肝细胞的靶向特异性，从而进一步减少潜在的脱靶效应，并为ACE-tRNA在HBV感染中的治疗应用提供进一步的安全保证。

基因重叠在病毒基因组中广泛存在，使病毒能够在相对较小的基因组中编码更多信息。对于HBV基因组，C ORF和P ORF的部分重叠，以及C ORF终止密码子后面另一个高度保守的框内终止密码子，使得C ORF的终止密码子类似于PTC。在本研究中，发现HBc的终止密码子是UAG且高度保守，表明HBc翻译的正常终止对HBV复制至关重要。ACE-tRNAs，包括tRNA^SUAG、tRNA^LUAG和tRNA^QUAG，可以通读HBc的终止密码子，这可能是因为HBc的终止密码子与PTC相似。在三种ACE-tRNA中，只有tRNA^SUAG能有效降低HBc蛋白水平。值得注意的是，tRNA^SUAG还能显著降低HBsAg、HBeAg、HBV RNA和HBV DNA的水平。尽管HBeAg也位于C ORF，但tRNA^SUAG不应直接影响HBeAg水平，因为其C末端结构域在HBeAg加工过程中被移除。一旦HBc的终止密码子从UAG突变为UAA，tRNA^SUAG介导的HBc蛋白水平下降及其对HBV复制的抑制作用就会消失，这证实了tRNA^SUAG可以通过通读HBc的终止密码子降低HBc蛋白水平并抑制HBV复制。由于紧接在HBc终止密码子UAG后面的核苷酸是U，且在C ORF中高度保守，并且与UAGA、UAGG和UAGC相比，UAGU最容易被tRNA^SUAG通读，这也可以部分解释为什么ACE-tRNA可以通读HBc的终止密码子。当阻断HBc表达或补充不受tRNA^SUAG影响的HBc表达时，tRNA^SUAG抑制HBV复制的作用消失，表明tRNA^SUAG介导的HBV复制抑制是通过降低HBc蛋白水平实现的。与我们的结果一致，一些CAMs，包括GLS4和Bay41-419，可以通过降低HBc水平或影响衣壳形成显著降低HBs