利用CRISPR干扰技术探究副结核分枝杆菌在THP-1细胞内的生存机制及其毒力基因功能分析

本研究利用CRISPR干扰（CRISPRi）技术，靶向沉默副结核分枝杆菌（MAP）的四个毒力相关基因（mdh、pknG、MAP1981c和icl），系统评估了其在人类THP-1巨噬细胞中的细胞内生存能力。研究发现，基因沉默显著抑制了MAP的菌团形成和存活率，并增强了宿主细胞活力。该工作为MAP致病机制研究和抗感染策略开发提供了新见解。

　　

引言

副结核分枝杆菌（Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, MAP）是约内病（Johne’s disease）的主要病原体，对畜牧业造成严重经济损失，同时被怀疑与人类克罗恩病（Crohn’s disease, CD）的发病相关。MAP的核心致病机制涉及其在宿主巨噬细胞内的持久存活能力，从而逃避免疫清除并导致慢性感染。尽管MAP的兽医和公共卫生意义重大，但针对其对人类巨噬细胞毒力的研究仍较为有限。

先前研究间接提示多个MAP基因可能参与细胞内存活过程，包括：

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  malate dehydrogenase（mdh），参与三羧酸循环（TCA cycle）和宿主免疫应答调节；

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  protein kinase G（pknG），在其他分枝杆菌中已知可抑制吞噬体-溶酶体融合；

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  MAP1981c，一种推测的核酸结合蛋白，具高度免疫原性；

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  isocitrate lyase（icl），是乙醛酸循环的关键酶，帮助病原体在营养限制条件下存活。

然而，这些基因在MAP感染人类细胞过程中的具体功能尚未通过直接遗传学手段验证。

CRISPR干扰（CRISPR interference, CRISPRi）技术通过dCas9蛋白实现基因表达的精准、可逆抑制，特别适用于研究必需基因或难以敲除的病原体。该技术已在结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）等物种中成功应用，但在MAP中的开发和应用仍属空白。

本研究利用CRISPRi技术构建MAP基因沉默突变体，结合细胞感染实验、转录组分析和超微结构观察，深入探讨了mdh、pknG、MAP1981c和icl在MAP胞内生存中的作用，为理解MAP致病机制及开发新型防控策略提供了实验依据。

CRISPRi基因沉默系统的构建与验证

研究采用pLJR965质粒系统表达dCas9蛋白和靶向sgRNA，成功构建了针对mdh、pknG、MAP1981c和icl的MAP CRISPRi突变体。通过添加不同浓度脱水四环素（anhydrotetracycline, ATc）诱导基因沉默，qRT-PCR结果显示，ATc浓度在5 μg/mL时可使目标基因表达下调约四倍，而在30 μg/mL时抑制效果可达六倍以上。

细菌存活实验显示，mdh基因的沉默导致MAP在液体培养中存活率显著下降（最高超过2 log₁₀），而pknG、MAP1981c和icl的沉默对细菌体外生长影响较小，说明mdh在MAP基础代谢中具有更关键的作用。

ATc浓度对THP-1巨噬细胞存活与感染的影响

为优化感染实验条件，研究评估了ATc对THP-1巨噬细胞的细胞毒性。WST-8实验表明，ATc浓度在5 μg/mL以下时对细胞活力无显著影响，而浓度升高至30 μg/mL则导致细胞存活率下降超过50%。

在MAP感染THP-1细胞的模型中，加入1–5 μg/mL ATc可有效诱导基因沉默，且不会引起显著宿主细胞毒性。值得注意的是，感染mdh、MAP1981c或icl沉默菌株的巨噬细胞，在ATc存在下存活率明显上升，提示细胞内细菌负荷减少。这一结果通过CFU计数进一步证实：上述三种突变体的胞内存活能力随ATc浓度增加而显著降低。

基因沉默对MAP胞内存活时间的影响

研究人员在感染后72小时内动态监测了MAP突变体在THP-1细胞中的存活情况。发现在感染早期（24小时），各突变体与野生型MAP之间无显著差异；然而至48和72小时，mdh、MAP1981c和icl沉默株的CFU显著下降（超过1 log₁₀），而pknG沉默株的减少幅度较小。

这些结果说明，mdh、MAP1981c和icl在MAP感染中后期发挥关键作用，可能涉及代谢适应和免疫逃逸机制；而pknG在人类巨噬细胞感染模型中的作用相对有限。

菌团形成与超微结构分析

通过透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）观察发现，野生型MAP及未加ATc的突变体在感染后24和72小时可在吞噬囊内形成明显菌团（clump），其面积多超过6 μm2。而在ATc诱导的mdh、MAP1981c或icl沉默组中，细胞内细菌多呈分散状态，菌团形成显著减少。

相比之下，pknG沉默并未明显影响菌团形态。这一结果从结构层面验证了基因沉默对MAP在细胞内聚集和生存能力的抑制作用，进一步支持前述表型结论。

讨论

本研究首次在MAP中成功建立并优化了CRISPRi基因功能分析平台，实现了在人类巨噬细胞感染背景下对特定毒力基因的可控沉默。研究发现，mdh、MAP1981c和icl基因的沉默显著损害MAP在THP-1细胞中的存活和菌团形成能力，并提高了宿主细胞的生存率。

其中，mdh作为TCA循环中的关键酶，可能影响MAP在低氧环境下的能量代谢；MAP1981c作为一种免疫显性抗原，可能参与早期感染中的免疫识别与调节；icl则通过乙醛酸循环支持MAP在营养胁迫条件下的持久存活。这些基因因此成为潜在的治疗靶点。

尽管pknG在其他分枝杆菌（如Mtb）中已知具有抑制吞噬体成熟的功能，本研究显示其在MAP感染人源巨噬细胞过程中的作用不如上述基因显著，提示MAP与Mtb在致病机制上可能存在差异。

本研究还结合了CFU计数、qPCR和TEM等多种技术，综合评价了基因功能及其表型效应，为MAP致病机制研究提供了多维度证据。值得注意的是，THP-1细胞系虽为常用模型，但其与原发性巨噬细胞在免疫应答上可能存在差异。未来研究可进一步利用牛源巨噬细胞或体内模型验证上述发现。

材料与方法

菌株与培养

实验所用MAP菌株为ATCC BAA-968（K10），培养于添加OADC和Mycobactin J的Middlebrook 7H9液体培养基或7H10固体培养基。必要时加入卡那霉素（50 μg/mL）和/或ATc（1–30 μg/mL）。

CRISPRi突变体构建

使用pLJR965质粒系统，针对mdh、pknG、MAP1981c和icl基因设计sgRNA，通过电转导入MAP感受态细胞，并经抗性筛选和测序验证获得突变体。

基因表达与细菌存活分析

通过qRT-PCR检测基因沉默效率，以sigA作为内参基因。细菌存活率通过CFU计数评估。

细胞感染与毒性检测

THP-1细胞经PMA诱导分化为巨噬细胞后，以感染复数（MOI=10:1）与MAP共培养。利用WST-8法检测细胞活力，通过CFU评估胞内菌存活情况。

透射电镜样品制备与成像

感染细胞经锇酸和醋酸铀固定、脱水、树脂包埋和超薄切片后，使用JEM-1010透射电镜观察并拍摄图像。

统计方法

数据以均值±标准差表示，使用GraphPad Prism 9进行ANOVA和Tukey多重比较检验，P值小于0.05视为显著。