Dlc1缺失通过早期激活经典Wnt通路调控小鼠胚胎干细胞心脏定向分化的机制研究

本研究针对心脏发育过程中Dlc1基因的功能机制这一关键科学问题，通过构建Dlc1基因敲除小鼠胚胎干细胞模型，结合多组学分析和功能验证实验，首次揭示Dlc1缺失通过促进β-catenin核转位激活经典Wnt信号通路，进而增强中胚层定向分化与心脏祖细胞富集，但最终导致心肌细胞生成障碍的分子调控网络，为先天性心脏病发病机制提供了新的理论依据。

　　

在胚胎发育的奇妙旅程中，心脏是最早开始功能活动的器官，其形成过程涉及精密复杂的细胞命运决定和信号网络调控。尽管已知BMP、WNT、Notch和FGF等多个信号通路参与心脏发育的时空调控，但这个调控网络的细节仍存在大量未知领域。特别值得注意的是，Dlc1（Deleted in Liver Cancer 1）基因在多种实体瘤中作为肿瘤抑制因子发挥作用，但其在胚胎发育特别是心脏形成过程中的功能却鲜为人知。先前研究发现Dlc1敲除小鼠无法存活超过10.5天胚胎期，并出现心脏腔室扭曲、心房心室异常扩大等表型，这提示Dlc1可能在心脏发育中扮演重要角色。

为了深入探究Dlc1在心脏发育中的具体作用机制，研究人员利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了Dlc1敲除的小鼠胚胎干细胞（mESC）单克隆细胞系，并建立了mESC-心肌细胞分化模型。通过流式细胞术、实时荧光定量PCR、畸胎瘤形成实验、RNA测序等多种细胞和分子生物学技术，系统分析了敲除细胞系在不同分化阶段的细胞进程和分化能力。

研究团队采用的主要关键技术方法包括：CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Dlc1敲除细胞系、小鼠胚胎干细胞定向心肌细胞分化模型、RNA测序与生物信息学分析、Wnt通路抑制剂XAV-939挽救实验、β-catenin亚细胞定位与磷酸化水平检测等。所有实验均使用C57BL/6J遗传背景的小鼠胚胎干细胞，并通过至少三次独立重复实验确保结果的可靠性。

动态表达模式分析揭示Dlc1在心脏分化中的时序调控

通过免疫组化染色发现Dlc1在E12.5小鼠胚胎中广泛表达，包括体节间充质、鳃弓和心脏区域。在心脏中，Dlc1主要表达于心肌层和心内膜。在mESC向心肌细胞分化的过程中，总Dlc1表达在最初2天下降，随后从第4天开始逐渐增加。广泛表达的转录本（NM_015802）和心脏特异性转录本（NM_001194940.2）的表达模式与总Dlc1大致相似，但心脏特异性转录本的变化更为显著。这表明Dlc1可能参与心脏祖细胞的分化过程。

Dlc1敲除影响心肌细胞分化进程

研究发现Dlc1缺失不影响mESC的增殖和凋亡，也不改变多能性相关基因的表达。在悬滴分化过程中，Dlc1敲除的胚胎体（EBs）在第2天尺寸增大，但在第5天减小。虽然Dlc1敲除EBs在第9天表现出与野生型相似的搏动能力，但从第20天开始，Dlc1^-/- mESCs衍生的收缩EBs百分比逐渐下降。心肌细胞标志物肌钙蛋白T2（Tnnt2）和肌球蛋白重链6（Myh6）从分化第8天开始在Dlc1敲除EBs中下调，表明Dlc1缺失可能促进心脏祖细胞的分化和积累，但干扰后续的心肌细胞谱系规范。

转录组分析揭示胚层分化异常

RNA测序分析显示，在分化的第3天（原肠中胚层细胞向心前祖细胞分化阶段），Dlc1敲除导致1006个差异表达基因。GO分析发现前20条通路中多条与中胚层或内胚层细胞命运规范和心脏发育相关。GSEA显示这些生物过程在Dlc1敲除EBs中主要上调。中胚层和内胚层标志物如Mesp1、Mixl1、T、Foxa2、Sox17和Gata6表达上调，而外胚层标志物Pax6显著下调。这些发现通过实时PCR得到进一步证实，畸胎瘤实验也表明Dlc1敲除mESC具有形成三个胚层的能力，但促进中胚层形成并抑制外胚层形成。

Wnt信号通路调控机制解析

GO和KEGG分析显示Wnt信号在分化第3天富集，而在第5天和第9天不富集。GSEA证实经典Wnt通路在Dlc1敲除EBs的第3天显著上调，差异表达基因主要富集在β-catenin（Ctnnb1）靶基因上。使用Wnt通路抑制剂XAV-939进行的挽救实验表明，抑制剂处理的Dlc1敲除EBs尺寸增大，增殖能力恢复，中内胚层标志物表达显著下降，外胚层标志物表达恢复正常。荧光素酶报告基因分析显示Dlc1过表达下调Wnt/β-catenin信号活性。机制研究发现Dlc1缺失通过减少β-catenin的降解和促进其核转位来激活经典Wnt通路。

研究结论表明，Dlc1通过影响经典Wnt信号通路在早期阶段参与调控胚胎干细胞心脏分化。Dlc1缺失通过促进β-catenin核转位激活Wnt信号，进而增强中胚层定向分化与心脏祖细胞富集，但最终导致心肌细胞生成障碍。这一发现不仅揭示了Dlc1在心脏发育中的新功能，为先天性心脏病发病机制提供了新的理论依据，也为心脏再生医学研究提供了新的靶点。

值得注意的是，Dlc1作为RhoGAP家族成员，其调控Wnt信号通路的作用可能是RhoGAP非依赖性的，这可能通过其START结构域或丝氨酸富集区（SR region）介导。这种多功能的信号调控特性使Dlc1成为连接细胞骨架重排与信号转导的关键节点分子，在胚胎发育和疾病发生中扮演着复杂而精细的调控角色。

该研究的发现为理解心脏发育的分子机制提供了新的视角，Dlc1-Wnt-β-catenin轴可能成为先天性心脏病诊断和治疗的新靶标。同时，研究建立的Dlc1敲除mESC模型也为后续研究心脏发育疾病提供了有价值的实验工具。这些成果对推动心脏发育生物学研究和临床转化具有重要意义。