基于NanoLock与Craspase的CRISPR级联放大系统实现高灵敏无扩增RNA检测

本研究针对RNA检测中存在的扩增依赖、耗时较长及气溶胶污染等问题，开发了一种基于III-E型CRISPR-Cas系统Craspase蛋白酶活性与NanoLock高灵敏度发光技术联用的新型检测平台CNC。该平台通过CRISPR引导的蛋白酶切割反应与生物发光信号输出相结合，实现了对SARS-CoV-2 N基因RNA在10分钟内达到250 fM的检测灵敏度，并成功拓展至IAV和HIV的检测，为传染病快速诊断提供了创新性技术路径。

　　

在生物医学研究和临床诊断领域，快速、灵敏的RNA检测技术对疾病早期诊断和病原体流行病控制具有重要意义。目前广泛使用的实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术虽为金标准，但仍存在依赖核酸扩增、操作时间长、仪器要求高、易产生气溶胶污染等问题，限制了其在现场快速检测（point-of-care testing, POCT）中的应用。尽管等温扩增技术在一定程度上简化了操作流程，但其引物设计复杂性和扩增偏差仍制约其进一步发展。近年来，CRISPR-Cas系统因其高特异性和程序化识别能力，为核酸检测带来了新的技术突破，特别是Cas13和Cas12系统已开发出多种检测工具，但仍需依赖核酸切割活性或信号放大步骤。

在这项发表于《Nucleic Acids Research》的研究中，山东大学微生物技术国家重点实验室古利川教授团队与中国科学院生物物理研究所合作，开发了一种名为CRISPR-guided caspase (Craspase)-NanoLock-Csx30（CNC）的新型RNA检测平台。该平台创新性地将III-E型CRISPR-Cas系统的RNA激活蛋白酶活性与NanoLock超灵敏发光技术相结合，实现了无需扩增的高灵敏度RNA检测。

研究人员采用的关键技术方法包括：1）蛋白质工程与纯化：通过原核表达系统制备DiCraspase复合物（含Cas7-11、crRNA和Csx29）及信号报告蛋白SLCH_396-565（SmBiT-LgBiT-Csx30_396-565-HiBiT^m）；2）体外转录（IVT）合成目标RNA；3）SDS-PAGE蛋白酶切验证；4）实时生物发光信号监测（使用furimazine底物）；5）临床样本模拟检测（包括鼻拭子、咽拭子和唾液样本）。

Principle and operation for RNA detection using the CNC platform

研究团队巧妙利用III-E型CRISPR-Cas系统中Craspase的RNA激活蛋白酶特性：当crRNA与靶标RNA（cognate target RNA, CTR）结合后，诱导Csx29发生构象变化，激活其蛋白酶活性并切割底物Csx30。通过将Csx30与NanoLock系统融合构建SLCH报告蛋白，在未激活状态下，HiBiT^m抑制肽与LgBiT结合抑制荧光信号；而当Craspase被激活后，切割释放HiBiT^m，使SmBiT与LgBiT结合形成活性荧光素酶，催化底物产生发光信号。

CNC platform for detecting the CTR1 SARS-CoV-2

针对SARS-CoV-2 N基因设计特异性crRNA（crRNA-1），成功纯化DiCraspase-1复合物并筛选出最优报告蛋白SLCH_396-565

Optimization of the CNC platform for detection of CTR1 SARS-CoV-2

通过系统优化确定最佳反应条件：温度37℃、pH 7.5、DiCraspase-1浓度50 nM、SLCH_396-565浓度100 pM。平台在不同缓冲体系中均表现良好稳定性，为实际应用奠定基础。

Sensitivity analysis of the CNC platform

单crRNA系统对合成CTR1 SARS-CoV-2和体外转录RNAN SARS-CoV-2的检测灵敏度均为2.5 pM。通过联合使用三个靶向SARS-CoV-2 N基因不同区域的crRNA（crRNA-1/2/3），灵敏度显著提升至250 fM，可在10分钟内完成检测，性能优于多数CRISPR-Cas核酸酶检测系统。

Specificity and anti-interference of the CNC platform

系统对单/双点突变RNA的识别能力显著下降，证明其严格序列特异性。在七种冠状病毒RNA中仅对SARS-CoV-2产生响应，无交叉反应。在非特异性RNA背景干扰下（靶标RNA占比0.5%），仍保持80%检测效率。在临床样本基质（鼻拭子、咽拭子、10%唾液）中维持250 fM检测限，展现强抗干扰能力。

CNC platform for the detection of IAV and HIV

平台成功拓展至甲型流感病毒（IAV）核蛋白基因和人类免疫缺陷病毒（HIV）gag基因检测，分别达到1 pM和2.5 pM的灵敏度， demonstrating broad applicability。

该研究首次将III-E型CRISPR-Cas系统的蛋白酶活性与生物发光信号输出系统相结合，建立了新型无扩增RNA检测平台CNC。其250 fM的检测灵敏度、10分钟快速反应、强抗干扰能力和多靶标适用性，为传染病现场诊断提供了具有转化潜力的创新技术。相较于基于核酸切割的CRISPR检测方法，该平台通过蛋白水平信号转换规避了核酸扩增带来的偏差和污染风险，且SLCH报告蛋白制备简便、成本低廉。未来通过crRNA优化、固相化系统开发、检测设备升级和Craspase同源物挖掘，有望进一步提升检测性能，推动CRISPR诊断技术在POCT领域的应用拓展。