芳香化酶基因Cyp19a1aA/Cyp19a1aB双等位基因编辑诱导鲤性别逆转及全雌种群构建研究

本研究针对鲤科鱼类性别决定机制不明和单性育种技术瓶颈，通过CRISPR/Cas9技术靶向编辑鲤芳香化酶基因Cyp19a1aA/Cyp19a1aB，首次在F0代嵌合突变体中实现XX遗传雌性向生理雄性的性逆转，并成功培育出生长性能提升12.06%的全雌种群，为鱼类性别控制育种提供了无需性类固醇激素干预的创新方案。

　　

在鱼类养殖业中，性别控制育种是提升经济效益的重要策略。许多鲤科鱼类呈现雌性生长优势，但因其同型性染色体和性别决定基因（SDG）不明，传统激素诱导法存在环境污染与食品安全隐患。鲤作为四倍体模式物种，其性腺分化的分子机制尚不清晰，尤其芳香化酶（Cyp19a1a）在雌激素合成中的双等位基因功能冗余性未有定论。

为解决上述问题，中国科学院水生生物研究所殷战团队通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，靶向鲤Cyp19a1aA和Cyp19a1aB基因第三/第二外显子共享序列，在F0代嵌合突变体中观察到XX遗传雌性向生理雄性（新雄鱼）的性逆转现象。研究发现突变比例与性逆转率呈正相关，且新雄鱼与野生型雌鱼杂交可产生100%全雌后代，群体生长速度显著提升12.06%。该研究发表于《Applied Physiology Nutrition and Metabolism》，为鱼类性别分化机制解析和绿色育种技术开发提供了突破性进展。

研究采用以下关键技术：

1. 1.

   CRISPR/Cas9基因编辑构建Cyp19a1aA/B嵌合突变体；

2. 2.

   黄河鲤（宁夏渔业研究所提供）雄性特异性DNA标记进行遗传性别鉴定；

3. 3.

   酶联免疫吸附测定（ELISA）量化血浆睾酮、11-酮睾酮和雌二醇浓度；

4. 4.

   组织学分析（H&E染色）评估性腺分化状态；

5. 5.

   人工授精与全雌种群培育。

3.1 Cyp19a1aA和cyp19a1aB等位基因在鲤中被敲除

通过氨基酸序列比对发现鲤Cyp19a1aA/Cyp19a1aB与斑马鱼直系同源蛋白相似度达86%以上。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和Sanger测序证实F0群体中存在四类基因型：野生型、Cyp19a1aA单突变、Cyp19a1aB单突变及双突变嵌合体。

3.2 Cyp19a1aA、cyp19a1aB或双基因嵌合突变使鲤从雌性逆转为雄性

解剖与组织学分析显示，嵌合突变群体中部分XX个体出现雄性第二性征（鳃盖瘤、鳍条追星）及睾丸分化，其中Cyp19a1aA、Cyp19a1aB和双突变组的性逆转率分别为23.5%、20.0%和50.0%。表明双等位基因在卵巢分化中均不可或缺。

3.3 雌性与雄性/新雄鱼鲤之间观察到性类固醇浓度差异

ELISA检测发现对照组雌鱼雌二醇浓度显著高于雄性（p<0.0001），而嵌合突变雌鱼雌二醇水平介于对照组雌鱼与新雄鱼之间。新雄鱼睾酮与11-酮睾酮浓度与野生型雄性无显著差异，证实雌激素不足直接导致性逆转。

3.4 Cyp19a1aA、cyp19a1aB、双基因嵌合突变比例与雌向雄性逆转比例呈正相关

TA克隆测序显示性逆转个体均携带100%突变等位基因，而未逆转雌鱼突变比例低于100%，证明突变剂量依赖性效应。

3.5 利用Cyp19a1a缺陷新雄鱼成功生成全雌种群

新雄鱼（XX基因型）与野生型雌鱼杂交子代经雄性特异性标记鉴定均为雌性（100%）。全雌群体（AF-3）4月龄体重较混养对照组显著增加12.06%（p<0.05），体现雌性生长优势。

研究结论强调：

1. 1.

   Cyp19a1aA和Cyp19a1aB在雌激素合成中功能非冗余，任一基因突变均可突破XX遗传性别导向睾丸分化；

2. 2.

   首次在F0代嵌合体中直接获取可育新雄鱼，避免了传统激素法环境残留问题；

3. 3.

   建立了一种快速（1-2年）、高效的全雌鲤育种技术路径，为无SDG信息鱼类的性别控制提供普适性方案。

   该成果不仅深化了对脊椎动物性腺分化保守机制的理解，更推动了水产育种向精准、环保方向革新。