序贯因子递送策略实现临床级iPSCs通用基因编辑的高效工作流程

本研究针对临床级诱导多能干细胞（iPSCs）基因编辑效率低且难以符合药品生产质量管理规范（GMP）的难题，开发了一种无病毒、无筛选标记的序贯因子递送方法。通过优化核转染条件与冷刺激处理，成功将全长转基因敲入效率提升至30%以上，并构建了HLA I类缺陷型且携带可诱导Caspase-9自杀基因的纯合子iPSC系。该工作为细胞治疗提供了兼具高效性与合规性的通用型基因编辑平台。

　　

人类诱导多能干细胞（iPSCs）因其无限分化潜能已成为细胞治疗领域的重要起点。通过CRISPR基因编辑技术，研究人员可对iPSCs进行精准遗传改造，例如引入自杀基因提升治疗安全性，或修饰人类白细胞抗原（HLA）基因以增强免疫兼容性。然而，iPSCs中的基因敲入（KI）效率普遍较低，且传统增效策略（如抗生素筛选或复杂仪器分选）往往与药品生产质量管理规范（GMP）要求冲突。病毒载体递送虽能提高效率，但其GMP级生产工艺复杂、成本高昂。因此，开发一种高效、合规且无需复杂设备的基因编辑平台成为迫切需求。

为解决上述问题，Catalent杜塞尔多夫有限公司的Thomas Berger、Boris Greber团队在《Scientific Reports》发表研究，通过系统性优化核转染流程与反应条件，建立了基于序贯因子递送的无病毒基因编辑工作流程。该研究使用两组临床级GMP iPSC系（R26和R36），通过核转染技术递送基因编辑元件，并通过流式细胞术、PCR基因分型、RT-qPCR、细胞毒性实验等功能验证手段评估编辑效果。

研究方法主要包括：使用Lonza 4D核转染仪与P4缓冲液进行程序化电转；采用核糖核蛋白（RNP）复合物（Cas9或Cas12a与gRNA复合体）与标准质粒载体；通过序贯递送策略（首日转染 donor 质粒，24小时后转染RNP）提升效率；引入32°C冷刺激促进同源定向修复（HDR）；使用RPMI培养基复苏增强细胞存活率；通过有限稀释法进行单克隆筛选；采用干扰素γ（IFNγ）刺激结合HLA-I流式检测筛选纯合编辑克隆。

Serial factor delivery is a key requirement for efficient knock-ins

研究团队以AAVS1位点GFP敲入为模型系统，发现RNP与donor共转染会导致细胞存活率与KI效率显著降低。而将两者分开并于不同日期序贯递送后，KI效率从3%提升至40%。关键优化步骤包括：扩大首次核转染细胞数至3×10⁶、冷刺激处理、使用富营养培养基预培养。该策略对Cas9与Cas12a同样有效，且在不同基因组位点（AAVS1与B2M）及不同iPSC系中均保持高效，表明其具有普适性。

One-step iCaspase9 KI and B2M KO using optimized workflow

研究人员将包含CAG启动子的诱导型Caspase9（iCASP9）表达框靶向B2M基因第一内含子，实现单步骤同时完成iCASP9敲入与B2M敲除。B2M蛋白缺失导致HLA-I类分子无法膜表达，从而逃逸T细胞识别。通过IFNγ刺激与HLA-I流式筛查，可快速鉴别纯合编辑克隆（HLA-I阴性）。在R36系中，双等位基因编辑效率达20%，R26系为5%。

Edited iPSCs lack HLA-I surface expression and carry functional suicide cassette in the correct genomic locus

经PCR与RT-qPCR验证，筛选出的克隆（R26-iC与R36-iC）均实现正确位点双等位基因整合，B2M mRNA完全缺失且iCASP9高表达。核型分析显示无染色体异常。功能实验表明，1 nM AP20187（CID）处理48小时可100%清除编辑细胞，而掺入0.005%野生型细胞的对照组仍能形成菌落，证明自杀系统高效且全覆盖。

Edited cells are fully competent for differentiation and retain transgene expression and activity

编辑后iPSCs成功分化为心肌细胞、视网膜色素上皮（RPE）细胞和自然杀伤（NK）细胞。心肌细胞中心肌肌钙蛋白表达率达90%以上，且CID处理可完全清除编辑细胞。RPE细胞高表达PMEL17与TYRP（>95%），iCASP9 mRNA维持高表达，0.1 nM CID即可实现完全杀伤。NK细胞分化效率接近99%（CD56⁺），且缺乏HLA-I表达。细胞毒性实验显示编辑NK细胞对K562肿瘤细胞的杀伤能力在高效靶比（5:1）下与野生型相当。混合培养实验中，CID处理可特异性清除HLA-I阴性（编辑）NK细胞，野生型细胞不受影响。

讨论与结论

本研究建立的序贯因子递送方案突破了iPSCs基因敲入的效率瓶颈，且完全符合GMP要求：无需病毒载体、抗生素筛选或复杂分选设备。通过单步骤实现B2M敲除与iCASP9敲入，不仅简化了流程，还降低了多重编辑带来的脱靶风险。编辑后细胞在多谱系分化后仍维持转基因表达与功能，证明了该平台在细胞治疗中的广泛应用潜力。

需要注意的是，尽管PCR与流式结果支持双等位基因整合，但仍需全基因组测序（WGS）排除复杂重排事件。此外，HLA-I缺失可能引起NK细胞活性变化，需进一步评估免疫豁免策略的完整性（如补表达CD47或HLA-E）。

该研究为临床级iPSCs的通用型基因编辑提供了高效、灵活且合规的技术平台，有望加速下一代细胞疗法的开发与应用。