嗜热球菌CAS-Cas4对分支DNA的加工：揭示核酸酶活性新机制及其在CRISPR适应性免疫中的意义

本研究针对古菌中CRISPR相关CAS-Cas4蛋白功能未充分表征的问题，通过对Thermococcus onnurineus来源的TON_0321蛋白进行生化研究，发现其具有5′→3′外切酶和独特结构依赖性内切酶活性，能特异性识别DNA分支点并在分支点5′方向2-3核苷酸处切割，拓展了Cas4蛋白的酶学功能认知，为CRISPR系统适应性模块的机制研究和新型基因编辑工具开发提供新视角。

　　

在细菌和古菌的适应性免疫系统中，CRISPR-Cas系统通过整合外源病毒序列（称为“间隔”）到宿主基因组中，形成对病原体的记忆性防御。这一过程由CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）介导，其中适应模块通常包含Cas1、Cas2和Cas4蛋白。Cas4蛋白根据其基因组定位分为CRISPR相关Cas4（CAS-Cas4）和独立存在的Solo-Cas4两类。尽管CAS-Cas4在CRISPR适应中具有重要作用，但古菌来源的CAS-Cas4蛋白尚未得到生化表征，其功能机制和多样性仍不明确。

为了解决这一问题，研究人员对来自Thermococcus onnurineus NA1的CAS-Cas4蛋白TON_0321进行了系统的生化研究。该蛋白位于IV-C型CRISPR基因盒旁，与Cas2相邻但缺乏Cas1，其功能背景独特。研究通过蛋白纯化、突变体构建、酶活分析、结构模拟和结合实验等多种技术手段，揭示了TON_0321的酶学特性和分子机制。

研究采用的主要技术方法包括：蛋白表达与纯化（使用Ni-NTA亲和层析和尺寸排阻色谱）、位点定向突变（构建催化失活突变体TON_0321^D96A/E105A）、核酸酶活性分析（使用荧光标记的ssDNA、dsDNA及分支DNA底物）、 cruciform assay（使用含十字形结构的质粒pIRbke8^mut）、荧光各向异性（研究蛋白与DNA结合）、尺寸排阻色谱（分析蛋白寡聚状态）和体外双 pulldown assay（检测蛋白相互作用）。

Types of Cas4 systems

通过多序列比对和系统发育分析，研究人员将Cas4蛋白分为CAS-Cas4和Solo-Cas4两类，并发现TON_0321属于CAS-Cas4，其基因位于IV-C型CRISPR盒旁，与Cas6、Cas10、Cas11、Cas7、Cas5和Cas2相邻。这一分类为理解Cas4功能分化提供了进化基础。

TON_0321: Cas4 protein from Thermococcus onnurineus

研究发现TON_0321虽与Cas2相邻，但体外未能形成稳定复合物。通过AlphaFold2结构预测和比对，确认TON_0321具有保守的PD-(D/E)XK核酸酶超家族特征和RecB结构域，其催化中心与λ exonuclease类似，关键金属螯合残基D96和E105突变后酶活丧失。

Optimum catalytic conditions for TON_0321

TON_0321具有高热稳定性，在pH 8.0、125 mM NaCl和2.5 mM MgCl₂条件下活性最佳，可在35°C或55°C下进行反应，适应其嗜热来源特性。

TON_0321 exonuclease activity

酶活分析表明，TON_0321具有5′→3′外切酶活性，能逐步降解ssDNA产生寡核苷酸片段，而非单核苷酸。通过末端阻断实验和竞争实验，证实其以分布式方式作用，而非进行性方式。

Endonuclease activity of TON_0321 on dsDNA plasmid

TON_0321在35°C下不切割线性dsDNA，但在55°C下可切割可能因末端熔解形成的分支结构。Cruciform assay显示其可在含十字形结构的质粒上产生切口，表明其对分支DNA的内切酶活性。尺寸排阻色谱证实TON_0321在溶液中为单体。

Endonuclease activity of TON_0321 on branched DNA substrates

TON_0321能高效处理5′ flap、3′ flap和splayed arm等分支DNA底物，在Cy5标记链上分支点5′方向2核苷酸处产生特异性切割。结合实验显示其可与各种DNA底物结合，但催化活性依赖于分支结构。

Sequence vs structure dependency

通过序列反转实验，发现TON_0321的切割位点不依赖于序列，而由分支结构决定。结构模型显示其催化位点与带正电表面呈一定角度，可能通过DNA弯曲实现分支识别和选择性切割。

研究结论表明，TON_0321是首个古菌来源的CAS-Cas4蛋白，具有独特的结构依赖性内切酶活性和5′→3′外切酶活性，能特异性识别和切割分支DNA。与已知Solo-Cas4蛋白（如SSO0001、SSO1391和Pcal_0546）相比，TON_0321在底物特异性、切割机制和寡聚状态上均有显著差异。其功能可能涉及CRISPR间隔获取、DNA修复或核酸代谢等多种生物学过程。该研究不仅拓展了对Cas4蛋白功能多样性的认知，也为开发基于结构特异性核酸酶的基因编辑工具提供了新思路。论文发表于《Journal of Biological Chemistry》，为CRISPR系统和古菌生物学研究提供了重要参考。