基于RAA-CRISPR/Cas12a双模式荧光-侧流层析技术实现镰刀菌属多种病原的现场可视化检测

本研究针对镰刀菌属病原体快速检测需求，开发了一种整合重组酶辅助扩增（RAA）与CRISPR/Cas12a系统的双模式检测平台。通过设计三重标记ssDNA报告分子，实现了荧光实时监测与侧流层析试纸条（LFS）可视化验证，可在1小时内达到0.3 pg基因组DNA的属水平检测限，为资源有限地区提供了一种高灵敏、高特异的现场筛查方案。

　　

在全球粮食安全面临严峻挑战的背景下，镰刀菌属（Fusarium）病原体正成为威胁谷物生产的隐形杀手。这些微小真菌不仅导致小麦赤霉病、玉米穗腐病等毁灭性病害，造成作物减产超过30%，更可怕的是它们会产生多种剧毒霉菌毒素，通过食物链危及人畜健康。传统检测方法如表型分析和PCR技术虽灵敏度较高，但依赖热循环仪等专业设备，难以在田间现场快速应用。虽然重组酶聚合酶扩增（RPA）技术提供了等温检测方案，但仍存在交叉反应和假阳性问题亟待解决。

针对这一技术瓶颈，天津市农业科学院农产品安全与营养研究所的范苏、王硕等研究人员在《Journal of Future Foods》上发表了一项创新性研究，开发了一种基于RAA-CRISPR/Cas12a的双模式可视化检测系统。该研究主要运用了重组酶辅助扩增（RAA）技术、CRISPR/Cas12a基因编辑系统、侧流层析试纸条（LFS）检测以及荧光信号监测等关键技术方法，所有实验菌株来源于河北农业大学和天津市农业科学院提供的参考菌株及田间分离株。

研究通过以下系统性实验验证了该检测平台的性能：

3.1. 细胞裂解对快速gDNA释放的效果

研究人员比较了锆珠研磨、碱裂解和磁珠纯化三种DNA提取方法，发现10分钟的锆珠研磨处理产生的粗提液与碱裂解法效果相当，且与等温扩增技术兼容，无需复杂纯化即可直接用于RAA反应。

3.2. RAA检测方法的开发与优化

通过筛选保守序列和物种特异性标记，研究人员设计了针对镰刀菌属ITS rDNA、尖孢镰刀菌（F. oxysporum）细胞色素P450基因、轮枝镰刀菌（F. verticillioides）钙调蛋白基因和禾谷镰刀菌（F. graminearum）特异性基因的引物组合。优化确定39°C反应30分钟为最佳扩增条件。

3.3. 双模式Cas12a可视化检测系统的优化

通过浓度梯度实验确定了50 nM Cas12a、500 nM crRNA和200 nM ssDNA报告分子的最优配比，集成三重标记报告分子（5’-FAM-TTATT-BHQ1-TTATT-Biotin-3’）实现了荧光实时监测和LFS验证的双重检测功能。

3.4. 镰刀菌属和物种特异性序列检测的特异性

测试17种病原真菌菌株显示，该体系对镰刀菌属7个种均能产生特异性荧光和T线信号，而对非靶标真菌和植物样本无交叉反应，证实了其高度特异性。

3.5. 分子水平镰刀菌检测的灵敏度

使用纯化gDNA评估显示，属水平检测限达0.3 pg/反应，物种特异性检测限为3 pg/反应，灵敏度超越常规PCR（10-100 pg），与TaqMan qPCR（1-5 pg）相当。

3.6. 模拟田间样品中镰刀菌检测的灵敏度

在雨水、小麦叶片和土壤等复杂基质中，属水平检测限分别为10¹、10²和10³分生孢子/反应，证实了该体系在实际应用场景中的可靠性。

该研究成功建立了一种可在1小时内完成检测的双模式RAA-Cas12a可视化检测系统，实现了镰刀菌属病原体的快速、特异、高灵敏现场检测。该系统创新性地整合了荧光实时监测和LFS验证两种模式，通过内置交叉验证机制显著降低了假阳性和假阴性风险。虽然复杂基质如土壤样品会略微降低检测灵敏度，但通过分级检测策略（先属水平筛查后物种确认）有效解决了这一局限。该技术平台不仅为镰刀菌病害监测提供了强有力的工具，更为资源有限地区的作物病害管理提供了切实可行的解决方案，对保障粮食安全和农产品质量安全具有重要意义。研究人员还展望了未来将该系统与霉菌毒素检测技术结合，开发真菌-毒素同步快速检测方法的潜力。