番茄FIBRILLIN多基因家族调控质体小球结构与代谢的分子机制研究

这篇研究通过CRISPR-Cas9技术系统解析番茄FIBRILLIN（FBN）多基因家族在质体小球（PG）形成和类异戊二烯代谢中的功能。研究发现FBN成员（如SlFBN1/2a/4/7a）通过结构冗余和功能分化调控PG形态及脂质核心组成，其中SlFBN7a特异性影响花色苷酯化，SlFBN2a正向调节质体色原醇-8（PC-8）积累。高阶突变体（如fbn1,2a,4,7a）导致PG超微结构异常、类胡萝卜素（如八氢番茄红素）在PG中沉积减少，并伴随膜脂重塑。研究揭示了FBNs作为PG支架蛋白和代谢枢纽的双重作用，为植物脂质代谢区室化提供新见解。

　　

番茄FIBRILLIN多基因家族的功能解析

SUMMARY

质体小球（PG）是植物质体中储存脂溶性代谢物的关键区室，FIBRILLINs（FBNs）作为其主要结构蛋白，在番茄果实成熟期富含类胡萝卜素的色质体中高度表达。研究通过多重基因编辑技术构建了单基因及高阶fbn突变体（如fbn1,2a,4,7a），发现SlFBN1/2a/4/7a功能冗余但各具特异性：SlFBN2a促进PC-8积累，而SlFBN7a抑制该过程并调控花色苷酯化能力。

INTRODUCTION

PG由单层脂膜包裹中性脂质核心构成，其形态和组成随质体类型（如叶绿体与色质体）及环境胁迫动态变化。FBN家族含保守的质体脂质关联蛋白（PAP）结构域，拟南芥中14个成员中7个定位于PG。番茄作为研究模型，其SlFBNs在类胡萝卜素富集的色质体中高表达，但具体功能机制尚不明确。

RESULTS

1. 番茄色质体发育相关的PG定位FBNs

系统发育分析鉴定出15个SlFBNs，其中SlFBN1/2a/4/7a/8在花和果实高表达。亚细胞定位显示SlFBN4-YFP与PG标记AtFBN1a-CFP共定位，而SlFBN2a/7a分布更弥散。

2. CRISPR-Cas生成fbn突变体

通过多重编辑策略获得单基因（如fbn7a）和高阶突变体（如四重突变体fbn1,2a,4,7a）。免疫印迹证实突变体缺失目标蛋白，表型分析显示fbn7a和四重突变体花瓣颜色变浅。

3. SlFBNs调控类异戊二烯代谢

高阶突变体成熟果实中八氢番茄红素和六氢番茄红素降低60%，而番茄红素保留80%。SlFBN2a缺失使PC-8减半，SlFBN7a缺失则使其倍增，表明二者拮抗调控PQ-9衍生代谢物。

4. fbn突变体中类异戊二烯的区室化改变

亚质体分级显示高阶突变体的PG中类胡萝卜素沉积减少，α-生育酚和PC-8向膜组分转移。蛋白质组分析证实PG核心蛋白（如NDC1、VTE1）在高阶突变体中缺失。

5. SlFBN7a调控花色苷酯化能力

fbn7a花瓣中游离花色苷增加3倍，单/双酯比例下降30-35%。四重突变体表型更显著，且β-胡萝卜素含量异常升高，提示SlFBN7a通过调控PES1活性影响酯化。

6. FBN缺失导致PG形态异常

电镜观察发现高阶突变体的PG数量减少且形态不规则（直径>500 nm），部分与类囊体残迹相连。fbn2a中可见电子透明核心的巨型PG，而fbn7a的PG核心电子密度降低。

7. 脂质组重塑

非靶向脂质组显示高阶突变体中半乳糖脂（MGDG/DGDG）和甘油三酯（TAG）显著变化。靶向分析证实fbn7a缺失导致花瓣TAG减少，暗示其参与广义脂质酯化调控。

DISCUSSION

研究提出FBNs通过双重机制发挥作用：①作为PG结构支架防止融合（如SlFBN1/2a/4），②作为代谢枢纽招募酶类（如SlFBN2a-NDC1-VTE1复合体促进PC-8合成）。SlFBN7a可能通过形成酯化代谢微环境调控PES1活性。该工作为作物品质改良（如类胡萝卜素富集）和胁迫响应研究提供新靶点。

MATERIALS AND METHODS

技术体系涵盖CRISPR-Cas9载体构建（Golden Gate组装）、亚细胞分级（蔗糖密度梯度离心）、UPLC/HPLC代谢分析、透射电镜（Tecnai T12）及LC-MS/MS脂质组学（Agilent 6550 QTof）。数据分析采用MetaboAnalyst 4.0和Simca?17平台。