EASY-edit工具箱：实现细菌高通量单步定制基因编辑的突破性方法

本研究针对细菌基因编辑过程中需针对每个位点进行繁琐优化的问题，开发了EASY-edit系统。通过优化sgRNA和短同源臂修复模板，实现了大肠杆菌中操作元件的高效编辑，可快速构建突变体库和报告基因，为基因功能研究和生物工程应用提供了灵活高效的平台。

　　

基因编辑技术是生命科学研究和生物工程应用的核心工具。传统的细菌基因编辑方法通常依赖于同源重组系统（如λ-Red系统）与选择性标记（如抗生素抗性基因）的结合使用。虽然这些方法能够实现基因敲除或插入，但存在效率低（通常低于10%）、步骤繁琐（需要两步法进行无疤痕突变）且需要针对每个靶位点进行个性化优化等问题。近年来，CRISPR-Cas9系统的引入显著提高了编辑效率（在某些情况下可达100%），但其应用仍面临诸多挑战：例如，sgRNA（single guide RNA）的设计与筛选耗时费力，约50%的候选sgRNA无法有效切割靶位点；编辑系统需要预先导入宿主菌并制备感受态细胞；突变引入过程中可能伴随脱靶效应；并且编辑通常需要破坏靶序列或其附近的PAM（protospacer adjacent motif）序列，这限制了无疤痕编辑的灵活性。

为了解决这些限制，并简化细菌中的基因编辑流程，研究人员开发了一种名为EASY-edit（Engineered Assembly of SYNthetic operations for targeted editing）的新方法。该方法利用一套预先优化好的sgRNA和携带短同源臂（Homology Arms, HA）的修复模板（可以是双链或单链DNA），靶向一个精心设计的合成操作元（synthetic operon）的不同区域，实现高效、精准的单步编辑。这种设计不仅简化了操作步骤，还使得构建报告基因融合、突变体库以及多基因表达系统变得异常便捷。相关研究成果发表在《Nucleic Acids Research》上。

为开展本研究，作者主要采用了以下几种关键技术方法：首先，利用λ-Red同源重组系统在大肠杆菌K-12 MG1655衍生株（DJ624）的特定基因间区（argG-ybbX、yfiM-kgtP和mhpR-lacZ）构建了合成操作元；其次，使用了温度敏感型质粒pCREPE组成性表达Cas9蛋白并诱导表达λ-Red系统，以及可反选择的sgRNA表达质粒pSS9GR_sacB；第三，通过电转法将sgRNA质粒和修复模板共转化至预先制备的感受态细胞中，并通过抗性筛选和表型筛选（如荧光变化）获得编辑后的克隆；第四，利用桑格测序和全基因组测序（结合Nanopore和Illumina技术）验证编辑的精确性和脱靶效应；最后，通过荧光显微成像和酶标仪检测评估报告基因的表达水平。

效率与精确性

研究人员首先测试了针对合成操作元不同区域（启动子、翻译起始区TIR、报告基因等）设计的10条sgRNA的切割效率，发现其中9条能有效降低细菌存活率（3-5个数量级）。随后，他们使用51 bp同源臂的双链DNA修复模板，成功替换了操作元中的五个特定区域（如将Ptet启动子替换为更强的Pcp25，将mScarlet-I报告基因替换为纳米荧光素酶nluc等），编辑效率高达83%-98%。桑格测序显示，在126个克隆中仅发现6个存在点突变，突变率约为0.05/克隆。全基因组测序进一步表明，单次编辑后的平均脱靶突变率较低（约0.3/基因组），证明该系统的精确性较高。

短同源臂的应用

为了进一步提升系统的便捷性，作者探索了更短同源臂的可行性。实验表明，使用44 bp同源臂的双链DNA修复模板仍能保持接近100%的编辑效率，而22 bp则会导致效率骤降。更令人惊喜的是，使用单链DNA寡核苷酸作为修复模板时，30 nt的同源臂即可实现88%的编辑效率，这为利用合成寡核苷酸进行高通量突变体库构建奠定了基础。

系统的模块化与迭代编辑

EASY-edit系统的另一大优势在于其模块化设计。研究人员构建了多种衍生菌株（如PAR2-PAR7），这些菌株携带不同排列顺序、不同荧光蛋白（如快成熟变体mScarlet-I3和SYFP2）甚至降解标签（DAS4 degron）的操作元，均能被相同的sgRNA组靶向编辑。此外，通过反选择标记sacB，可轻松消除sgRNA表达质粒，实现多轮迭代编辑。例如，研究人员先在一轮编辑中将mScarlet替换为nluc，随后在第二轮中再将nluc替换为mScarlet-I3，效率仍高达93%。

多基因位点编辑

为了增强系统的灵活性，作者还将合成操作元整合到大肠杆菌染色体的其他位点（yfiM-kgtP和mhpR-lacZ）。这些位点的操作元同样能被预选的sgRNA高效编辑，编辑效率可达94%。此外，这些操作元携带不同的抗性基因（如卡那霉素、博莱霉素等），可通过转导轻松组合到同一菌株中，为复杂遗传回路的构建提供了便利。

应用实例：转录后调控研究

为展示EASY-edit的实际应用价值，研究人员构建了多种报告系统来研究转录后调控机制。例如，他们利用串联报告基因设计（上游为转录报告基因mSca，下游为翻译报告基因sfGFP）和mRNA水平报告基因（在目标基因片段后引入终止密码子和人工TIR），研究了已知受转录后调控的基因（如rpoS、bamA、fepA、sodB和ompD）。结果表明，mRNA水平报告基因能更好地区分翻译起始调控和mRNA稳定性调控，为解析复杂的基因调控网络提供了新工具。

饱和突变体库构建

最后，作者利用EASY-edit系统成功构建了bamA和fepA翻译起始区（RBS）的饱和突变体库。他们使用携带5个随机位点（A或G）的44 nt单链DNA寡核苷酸作为修复模板，一次编辑即可获得约2×10⁴个克隆，对32种可能序列的覆盖度超过500倍。测序分析显示，突变体库的序列分布与合成模板高度一致，证明了该库的无偏性和代表性，可用于后续的高通量筛选和深度突变扫描。

EASY-edit系统通过合成操作元和预优化sgRNA的组合，大幅简化了细菌基因编辑的流程，提高了编辑效率和精准度。该系统支持双链和单链DNA修复模板，兼容短同源臂，适用于多位点、多轮迭代编辑以及高通量突变体库构建。其模块化设计允许用户灵活构建各种遗传工具，从报告基因到复杂代谢通路均可高效实现。此外，该系统在转录后调控机制研究和定向进化等领域的成功应用，展现了其在基础研究和生物工程中的广泛潜力。尽管在大片段插入（如lacZ基因）时效率有所下降，但通过迭代策略和多位点设计可以部分克服这一限制。未来，EASY-edit有望适配至其他细菌物种，进一步推动微生物遗传学研究和合成生物学应用的发展。