基于CRISPR/Cas12a DTR系统的拓扑引导型双靶标RNA/DNA特异性检测新技术及其在口腔鳞癌诊断中的应用

为解决CRISPR/Cas12a系统依赖连续靶标激活、无法同时检测多靶标的问题，研究人员开发了拓扑引导的Cas12a双靶标响应（DTR）系统。该系统通过分裂crRNA片段和双Cas12a蛋白协同重构，实现了RNA和DNA非连续靶标的特异性AND逻辑检测，灵敏度达78 fM，并成功应用于口腔鳞癌临床样本中miR-155和miR-let-7a的同时检测，为分子诊断提供了高精度多靶标检测新平台。

　　

近年来，CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）/Cas系统彻底改变了分子生物学领域，为基因组编辑和调控提供了前所未有的精确性。其中，Cas12a作为II-C型RNA引导的DNA内切酶，不仅能够进行位点特异性切割（顺式切割），还能在识别crRNA（CRISPR RNA）间隔区互补序列后激活对任意单链DNA（ssDNA）的反式切割活性。这一特性催生了DETECTR、HOLMES等高灵敏度核酸检测平台，推动了即时诊断工具的发展。然而，现有Cas12a系统均依赖连续靶标DNA或RNA的激活机制，仅能实现单靶标检测。多靶标检测通常需要复杂逻辑门设计、微流控技术或动态分子电路，存在反应动力学慢、结构复杂和信号泄漏等问题。

为解决上述局限性，江庆元、金书琪、秦志超等研究人员在《Nucleic Acids Research》发表了题为“CRISPR/Cas12a DTR system: a topology-guided Cas12a assay for specific dual detection of RNA and DNA targets”的研究论文，开发了一种新型拓扑引导的Cas12a双靶标响应（Double-Target Responsive, DTR）系统。该系统通过分裂crRNA片段与双Cas12a蛋白协同作用，在识别两个非连续核酸激活剂时重构为功能复合物，首次实现了RNA和DNA混合靶标的特异性AND逻辑检测。

研究团队通过优化crRNA断裂位点组合（如T8+T12’），证实了双靶标协同激活的最高效率；利用冷冻电镜（cryo-EM）和动态光散射（DLS）验证了Cas12a二聚体复合物的形成；并通过荧光动力学分析、凝胶电泳和侧向流检测（LFA）等多种技术手段评估了系统的灵敏度、特异性及逻辑门功能。临床样本检测部分收集了7例口腔鳞癌（OSCC）患者和3例健康对照的肿瘤切除标本，经RNA提取后直接用于DTR检测。

研究结果主要包括：

1. 1.

   非连续靶标RNA激活的Cas12a DTR系统

   通过设计九组crRNA断裂位点组合，发现T8+T12’组合在激活Cas12a反式切割效率方面表现最优，与单靶标检测系统SCas12a相当。对照实验表明，仅存在单个spacer RNA或单个激活剂时系统无法有效激活，证实了双靶标依赖的拓扑重构机制。

2. 2.

   双输入依赖性与协同激活效应

   DTR系统的酶活性由双激活剂浓度共同调控，而非单一最低浓度决定，表现出浓度阈值和协同调节行为，为下游逻辑操作奠定了基础。

3. 3.

   RNA与DNA靶标的特异性双检测

   系统成功实现了AND逻辑门下的双miRNA、双ssDNA、双dsDNA以及RNA-DNA混合靶标检测。其中，使用伪杂交DNA（Pseudo hybrid DNA, PHD）激活剂可进一步提高RNA检测 kinetics。

4. 4.

   灵敏度与特异性评估

   DTR系统对miRNA的检测限低至78 fM（ssDNA激活剂）和767 fM（杂交DNA激活剂），且对单核苷酸变异（SNV）具有卓越特异性，尤其在RNA靶标中几乎所有位点均能区分错配。

5. 5.

   临床诊断应用

   在OSCC相关miR-155和miR-let-7a检测中，DTR系统成功区分患者与健康人群，并通过LFA strips实现可视化诊断，凸显其在快速 intraoperative 检测中的潜力。

该研究构建的Cas12a DTR系统突破了现有CRISPR检测技术的单靶标限制，通过拓扑引导的协同激活机制实现了多靶标、高灵敏度、高特异性的核酸检测。其AND逻辑门设计为复杂生物标志物组合检测提供了新思路，尤其在肿瘤 miRNA 谱分析、病原体多重检测和遗传变异筛查等领域具有广阔应用前景。未来需进一步优化系统在靶标浓度差异较大样本中的性能，并拓展其与便携式诊断设备的集成能力。