综述：基于时空分离策略整合核酸扩增技术与CRISPR系统的一锅法诊断研究进展与应用

本综述系统阐述了通过时空分离策略整合核酸扩增技术（NAATs）与CRISPR系统的一锅法诊断研究进展。文章深入解析了该领域存在的生化不相容性挑战（如Cas12a介导的顺式/反式切割干扰），重点评述了物理分隔与时序调控两大策略的机制特点与性能权衡，为POCT（床旁检测）系统开发提供了重要技术路线图。

　　

核酸扩增技术（NAATs）与CRISPR-Cas系统的整合推动了分子诊断领域的范式变革，这种融合既保留了CRISPR系统单碱基分辨率的特异性优势，又通过前置扩增环节实现了超高灵敏度检测。然而将两个生化过程整合至单一密闭体系的"一锅法"诊断却面临核心矛盾：NAATs需要持续合成核酸产物，而CRISPR效应酶（如Cas12a/Cas13）会通过反式切割活性（trans-cleavage）消耗这些产物并降解关键组分（如引物和报告分子）。这种动力学竞争关系成为一锅法技术发展的主要瓶颈。

为破解这一难题，研究者开发出时空分离两大策略。空间分离采用物理屏障将扩增与检测反应区隔，具体包括：

1）微流控芯片通过微通道网络实现试剂顺序传递与反应控制

2）相分离系统利用液液相分离形成微反应腔室

3）膜分隔装置借助半透膜选择性通透反应产物

4）固相固定化将酶系锚定在不同载体实现定位激活

这类方法能有效防止Cas蛋白对扩增产物的提前切割，但往往需要精密加工设备且增加制造成本。

时间分离策略则通过精巧的分子设计实现反应时序控制：

1）化学修饰法：对crRNA或Cas蛋白进行光裂解基团、热敏基团或化学阻断剂修饰，在特定刺激下激活

2）变构调控：设计变构开关蛋白，在扩增产物积累到阈值后触发构象变化

3）适配体调控：利用适配体-配体相互作用调控Cas蛋白活性

4）抗CRISPR蛋白：采用Acr蛋白暂时抑制Cas活性，再通过温度或pH变化解除抑制

这些方法保持了反应体系的均质性，但对时序控制的精确度要求极高。

在性能评估方面，一锅法系统在操作便捷性和防污染方面显著优于传统两步法，但其检测灵敏度（LOD）通常比qPCR低1-2个数量级。这主要源于：1）扩增效率受抑制 2）报告分子被非特异性切割 3）复杂样本基质干扰。针对这些局限，未来研究需聚焦于：开发高保真Cas变体、优化报告系统抗干扰能力、整合上游样本制备与下游信号读出了模块，以及建立标准化性能验证体系。

特别值得关注的是，时空分离策略的成功实施离不开对CRISPR效应酶机制的深度挖掘。Cas12家族（如Cas12a）依赖WED和PI结构域识别TTTN PAM序列，靶标结合后触发构象变化激活反式切割；Cas13则通过HEPN结构域实现RNA切割，其持续激活特性更易引发背景信号。这些特性直接影响隔离策略的设计原则——对于高背景活性的Cas蛋白需采用严格物理隔离，而低背景活性体系更适合时序调控方案。

在实际应用场景中，RPA（重组酶聚合酶扩增）与LAMP（环介导等温扩增）因其操作温度温和、扩增效率高等特点，成为与CRISPR联用的首选扩增技术。但研究发现RPA体系中的单链结合蛋白可能影响Cas蛋白的结合效率，而LAMP反应的高温环境（60-65°C）可能使某些Cas蛋白失活。这些发现促使研究者开发热稳定型Cas变体（如ThermoCas）或采用分段温度控制策略。

展望未来，一锅法诊断系统的发展将呈现多维创新趋势：在材料学层面，智能响应水凝胶可为试剂释放提供时空精准控制；在合成生物学层面，人工基因线路可实现扩增-检测的自反馈调控；在器件工程层面，纸基微流控与智能手机读出了平台的结合将大幅降低检测成本。这些跨学科融合创新有望真正实现实验室级别性能与POCT便捷性的统一，为传染病防控、癌症早筛、耐药基因检测等场景提供突破性技术支撑。