利用CRISPR–Cas9介导TcNPR3基因编辑创制非转基因抗病可可新种质

本研究报告通过CRISPR–Cas9技术靶向编辑可可（Theobroma cacao L.）的防御负调控因子TcNPR3基因，成功获得不含外源T-DNA插入的突变体植株。这些非转基因编辑植株在离体叶片接种实验中表现出对疫霉菌（Phytophthora）侵染的敏感性显著降低（病斑面积减少42%），转录组分析揭示其防御相关基因（包括活性氧生成、转录因子及病程相关蛋白基因）表达上调。该研究为可持续可可栽培提供了突破性策略，对改善全球可可产业具有重要意义。

　　

引言

可可（Theobroma cacao L.）作为全球价值1280亿美元巧克力产业的核心原料，其生产深受由多种疫霉菌（Phytophthora）引起的黑果病威胁，可导致高达30%的产量损失。传统育种手段因可可高度异交特性及漫长世代周期而进展缓慢，且转基因作物面临消费者接受度与监管壁垒。本研究聚焦于植物防御关键负调控因子TcNPR3（Non-expresser of PR genes 3），前期研究表明其功能缺失可增强抗病性，为通过基因组编辑技术创制非转基因抗病种质提供了理论依据。

材料与方法

研究选用携带TcNPR3特异性sgRNA的CRISPR–Cas9载体（pGSh16.1010）转化可可体细胞胚胎，获得T₀代转基因株系PSU-52与PSU-67。通过体细胞胚胎发生技术扩繁后，将T₀植株与非转基因亲本（Ker1-L与Sca-6）杂交，利用种子EGFP荧光筛选与PCR基因分型技术追踪T-DNA分离情况。采用PacBio长读长测序精确解析T-DNA插入位点与等位基因变异结构，并通过Illumina转录组测序（Quant Seq技术）分析突变体叶片基因表达谱。病原接种实验采用离体叶片法，以^Gh-ER 1349株系^{Phytophthora palmivora}接种48小时后量化病斑面积。

结果

3.1 T₀代编辑植株的遗传特征

测序证实PSU-52株系存在1058 bp缺失及8 bp插入，PSU-67株系在两个sgRNA靶位点各出现1 bp插入，均导致TcNPR3蛋白功能结构域破坏。Western blot与荧光检测验证Cas9蛋白及EGFP标记表达。

3.2 杂交后代转基因分离与表型

22株F₁代植株中7株完全缺失T-DNA但保留npr3突变等位基因（PSU-494/495/497/498/499/503/508）。这些非转基因植株在温室生长条件下与野生型表型无显著差异，但EGFP荧光检测与多重PCR证实其不含外源基因元件。

3.3 全基因组测序验证

PacBio测序（平均覆盖度6×）明确T₀亲本中T-DNA单一位点插入（PSU-52位于Chr2 REM19基因外显子；PSU-67位于Chr6 HSP70基因5'UTR），且F₁非转基因植株中未检测到任何T-DNA序列。突变等位基因呈现多样性，包括1042–1058 bp缺失、单碱基插入及复杂重排模式。

3.4 转录组调控网络重塑

与野生型相比，npr3突变体叶片中119个基因表达显著差异（62个上调，57个下调）。防御相关基因如几丁质酶^Chitinase5（3.2倍上调）、紫色酸性磷酸酶^PAP17（11.2倍上调）表达增强，而铁稳态调控因子^Ferritin2同源基因（5倍下调）及防御负调控因子^Nimin1/2表达抑制。GO富集分析显示"响应化学刺激""铁离子结合"等通路显著富集，表明TcNPR3通过调控活性氧（ROS）平衡与铁代谢参与基础防御状态调节。

3.5 抗病表型验证

离体叶片接种实验显示，所有npr3突变体（包括T₀及F₁非转基因植株）病斑面积平均减少42%（^p < 0.0005），且突变体间抗性无显著差异，证实抗病表型稳定遗传且不依赖外源基因存在。

讨论

本研究首次成功获得非转基因CRISPR编辑可可植株，通过TcNPR3功能缺失系统性激活植物基础防御机制。突变体中铁稳态重编程与ROS相关基因表达变化，与植物通过铁剥夺抑制病原或铁积累触发氧化爆发的双重防御策略相符。该技术路径可通过杂交分离实现外源基因剔除，符合美国农业部APHIS对非转基因作物的监管豁免标准（7 CFR Part 340），为热带多年生作物育种提供了新范式。目前这些种质已获准进行田间试验，未来将评估其在自然条件下的农艺性状与持续抗病性，对保障全球可可产业可持续发展具有重要意义。