问号钩端螺旋体哈德焦血清型宿主适应性基因组特征解析及其在反刍动物定植中的潜在分子机制

本研究发现问号钩端螺旋体哈德焦血清型（L. interrogans serovar Hardjo）具有独特的基因组特征，包括完整的cas3基因、thiM起始密码子修饰和88个血清型特异性正交群。这些特征可能通过增强生物膜形成能力（in vitro验证）和调控毒素-抗毒素系统等机制，促进该病原体在反刍动物肾脏和生殖道的长期定植，为理解钩端螺旋体病（Leptospirosis）的宿主适应性提供了重要分子依据。

　　

引言

钩端螺旋体病是由钩端螺旋体属细菌引起的人畜共患病，在全球范围内广泛分布。反刍动物是哈德焦血清型的主要储存宿主，该血清型能够长期定植于肾脏和生殖道。哈德焦菌株在分类学上属于两个不同的钩端螺旋体物种：问号钩端螺旋体（L. interrogans）和博氏钩端螺旋体（L. borgpetersenii）。然而，问号钩端螺旋体哈德焦血清型适应性的分子基础仍知之甚少。

材料与方法

研究对四株欧洲分离的问号钩端螺旋体哈德焦血清型（KR40、KR84、KR85、N116）进行了全基因组测序。采用限制性内切酶分析（REA）和核心基因组多位点序列分型（cgMLST）进行菌株鉴定。使用Illumina和Oxford Nanopore技术进行测序，通过混合组装策略获得基因组序列。比较基因组分析涵盖19个公开获取的问号钩端螺旋体基因组，使用OrthoFinder进行正交群分析，采用ADMIXTURE进行群体结构分析，并通过体外生物膜形成实验验证表型差异。

结果

样本特征

REA分析显示所有测试菌株的限制性图谱与问号钩螺旋体哈德焦血清型参考菌株Hardjoprajitno一致。cgMLST分析将所有四个分离株归类于cgMLST方案的第40簇（克隆群19），与问号钩端螺旋体Sejroe血清群哈德焦血清型的其他代表株聚集在一起。

基因组组装与注释

测序覆盖度达到42×（仅Illumina）至114×（混合组装）。KR40和N116菌株分别获得5个和4个环状contig的完整基因组。基因组大小在4.63-5.35 Mb之间，GC含量为34.96%-35.05%。平均预测基因数为3,930个，其中约96%为蛋白质编码基因。

比较基因组学

平均核苷酸一致性（ANI）分析显示哈德焦血清型菌株间的ANI值接近100%。编码序列数量与基因组长度呈正相关（Spearman相关系数0.734）。

群体结构与系统发育分析

群体结构分析（K=5）将所有哈德焦血清型菌株与其他血清型分开。系统发育树显示哈德焦血清型形成一个独立的进化枝，与伊cterohaemorrhagiae血清群亲缘关系最近。

变异识别分析与哈德焦特异性效应

变异识别分析（VCA）共检测到99,656个遗传变异。在高影响变异中，发现四个具有统计学意义的SNP：

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  G436_RS22205基因中的C到G置换引入提前终止密码子

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  G436_RS23575基因中的C到T置换影响假设蛋白

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  G436_RS15655基因中的C到T置换影响CRISPR相关解旋酶Cas3

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  G436_RS14945基因中的A到G置换将thiM起始密码子从ATG改为GTG

还鉴定出三个INDEL：

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  G436_RS23265中的T插入导致蛋白质编码序列丢失

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  G436_RS23350中的G插入和移码破坏编码序列

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  G436_RS18190中的插入缩短FecR家族蛋白

独特正交群鉴定

OrthoFinder鉴定出4,326个正交群，其中88个为哈德焦血清型特有。59个特有基因位于rfb位点外，包括：

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  移动元件相关蛋白

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  毒素-抗毒素系统组件

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  腺苷酸/鸟苷酸环化酶催化结构域蛋白

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  亮氨酸重复序列（LRR）结构域蛋白

这些基因在三个基因组区域中成簇分布，GC含量与基因组平均水平存在差异，提示可能通过水平基因转移获得。

生物膜形成

体外实验显示哈德焦血清型在21天静态培养中形成的生物膜量显著高于哥本哈根血清型和布拉迪斯拉发血清型。相衬显微镜观察证实哈德焦血清型形成更广泛和融合的生物膜结构。

讨论

研究表明问号钩端螺旋体哈德焦血清型形成一个独特的系统发育谱系，具有特定的高影响突变和独特基因内容。完整的cas3基因可能通过影响生物膜形成能力增强其在反刍动物生殖组织中的持久性。thiM起始密码子的改变可能影响硫胺素 salvage途径的效率。88个特有正交群中包含的移动元件、毒素-抗毒素系统和信号转导相关基因可能共同贡献于哈德焦血清型的基因组可塑性和适应潜力。增强的生物膜形成能力为其在宿主组织中的定植提供了表型基础。

结论

问号钩端螺旋体哈德焦血清型具有独特的基因组特征，包括完整的cas3基因、thiM起始密码子替换和88个特有正交群。这些特征可能通过增强生物膜形成能力和调控多种分子机制，促进该病原体在反刍动物中的适应性定植。研究结果为理解钩端螺旋体宿主适应的分子机制提供了重要见解。