猫传染性腹膜炎病毒非结构蛋白14/16甲基转移酶突变体减毒活疫苗的构建与免疫保护机制研究

本研究通过CRISPR-Cas9技术构建猫传染性腹膜炎病毒（FIPV）nsp14-N415A（dnsp14）和nsp16-D129A（dnsp16）甲基转移酶（MTase）活性位点突变株，证实其体外复制能力与亲本株QS-79相当，但可显著增强干扰素（IFN-β/ISG15）表达。动物实验显示突变株致病性降低75%，其中dnsp14诱导高滴度中和抗体（>1:156）并对50%猫提供免疫保护，为FIPV减毒疫苗设计提供新策略。

　　

FIPV nsp14 N415和nsp16 D129是关键的MTase活性位点

通过多冠状病毒序列比对发现，nsp14第415位天冬酰胺（N415）和nsp16第129位天冬氨酸（D129）在FIPV 79-1146、PEDV CV777等病毒中高度保守。AlphaFold2结构模拟显示，N415参与β-链形成以稳定S-腺苷甲硫氨酸（SAM）结合口袋，而D129通过氢键定位SAM靠近m⁷G（cap-0结构）。酶活实验证实，nsp14-N415A和nsp16-D129A突变使甲基转移活性分别降低89%和95%。

突变株dnsp14和dnsp16的拯救

利用CRISPR-Cas9对QS-79感染性克隆进行基因编辑，成功获得dnsp14和dnsp16突变株。Western blot和间接免疫荧光（IFA）在CRFK细胞中检测到病毒核衣壳蛋白（NP）表达，证实突变株可正常复制。

体外增殖与免疫应答增强特性

在CRFK和Fcwf-4细胞中，突变株与亲本株具有相似的生长动力学和合胞体形成能力。但qPCR显示，dnsp14/dnsp16感染24小时后，IFN-β和ISG15 mRNA表达量较QS-79提升3-5倍，其中dnsp16还显著诱导TNF-α上调，提示突变通过破坏RNA加帽（cap-0/cap-1）激活天然免疫。

体内致病性显著减弱

猫攻毒实验显示，10^5.5 TCID₅₀剂量下QS-79组100%死亡（9周内），而dnsp14/dnsp16组死亡率降至25%。病理学分析发现，QS-79组出现典型非干酪样肉芽肿，突变株仅见化脓性肉芽肿且器官病毒载量降低10-100倍。值得注意的是，dnsp14在脾脏和肺部复制活跃，诱导中和抗体滴度（1:1024）与野生株相当，而dnsp16抗体滴度仅1:64。

免疫保护效果差异

低剂量（10⁴ TCID₅₀）免疫时，dnsp16组存活率升至100%但无保护力；dnsp14组50%猫能抵抗QS-79致死攻击，幸存猫二次攻毒保护率达100%。机制分析表明，dnsp14通过持续刺激体液免疫产生高亲和力抗体，而dnsp16可能因抗体依赖性增强（ADE）效应加剧病理损伤——该组攻毒后器官病毒载量反超PBS对照组2-3倍。

讨论与应用前景

研究首次证实FIPV nsp14/nsp16 MTase活性与毒力直接相关，其中nsp14-N415A突变株兼具安全性与免疫原性。未来可联合删除ORF3/7等辅助基因进一步减毒，或与T细胞佐剂联用提升保护率。该策略为α冠状病毒属疫苗研发提供了保守靶点参考。