CRISPR/Cas9脱靶效应通过八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因敲除诱导甘蔗白化现象及其对生物燃料研究的启示

为解决甘蔗木质素生物合成对生物燃料生产的限制，研究人员利用CRISPR/Cas9系统靶向肉桂醇脱氢酶(CAD)基因进行编辑。意外发现设计的gRNA与八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因存在部分同源，导致90%转化植株出现白化表型。该研究揭示了gRNA精确设计对避免脱靶效应的重要性，为甘蔗遗传改良提供了重要技术参考。

　　

甘蔗(Saccharum officinarum)作为高生物量C₄作物，在生物燃料领域展现出巨大潜力。虽然第一代生物燃料主要来自蔗糖，但木质素造成的细胞壁抗降解性严重限制了纤维素和半纤维素的利用。这种由紫丁香基、愈创木基和对羟基苯基单元构成的复杂聚合物，正是研究人员试图通过基因编辑技术改造的目标。

研究团队选择甘蔗品种Co 86,032作为实验材料，针对木质素合成关键酶——肉桂醇脱氢酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase, CAD)设计特异性gRNA。将构建好的CRISPR/Cas9载体pRGEB31通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404转入甘蔗后，出现了令人意外的现象：约90%再生植株表现出白化症状。

深入分析发现，设计的CAD gRNA在PAM序列上游与八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase, PDS)基因609-616 bp区域存在非预期同源。实时荧光定量PCR证实白化植株中PDS表达量显著降低，PCR扩增结果进一步验证了这一发现。叶绿素a、b和总类胡萝卜素含量测定也显示白化植株中这些色素水平明显下降，确证了gRNA脱靶导致PDS基因功能丧失。

这项研究不仅揭示了CRISPR/Cas9系统在甘蔗基因编辑中潜在的脱靶风险，更凸显了gRNA设计精准度的重要性。研究人员强调，要实现CAD基因的特异性敲除，必须重新设计更具靶向性的gRNA序列。这些发现为今后甘蔗及其他作物的精准基因编辑提供了重要技术借鉴，对推动生物燃料作物遗传改良具有深远意义。