RELA缺失通过调控DVL1/β-catenin信号通路促进TP53R249S突变型肝癌进展及其靶向治疗潜力

这篇研究通过全基因组CRISPR/Cas9筛选发现RELA（NF-κB关键亚基）在TP53R249S突变型肝癌中具有抑癌作用。机制上，RELA缺失通过上调DVL1表达促进β-catenin核转位，激活Wnt/β-catenin通路驱动上皮-间质转化（EMT）和转移。临床数据显示RELA低表达与肝癌患者不良预后显著相关，而RELA激动剂桦木酸（BetA）可特异性抑制TP53R249S突变肿瘤生长，为精准治疗提供新策略。

　　

1 引言

肝细胞癌（HCC）作为全球癌症相关死亡的第三大原因，其发生发展与TP53突变密切相关。在黄曲霉毒素高暴露地区，90%以上TP53突变表现为R249S位点特异性突变。研究团队前期发现MYC和TP53^R249S共表达可使原代人肝细胞（PHHs）永生化，但不足以诱发肝癌，提示存在其他关键抑癌基因的失活。

2 结果

2.1 全基因组CRISPR筛选鉴定肝癌抑癌基因

通过GeCKO v2文库在移植NSI小鼠的MT-PHHs（MYC+TP53^R249S永生化肝细胞）中进行体内筛选，发现除已知抑癌基因NF2和CSK外，RELA的sgRNA显著富集。Gini指数分析显示sgRNA分布偏斜，75%的sgRNA在肿瘤组织中丢失，GO分析揭示这些基因参与细胞周期和干细胞特性调控。

2.2 RELA的抑癌功能验证

TCGA数据分析显示，RELA低表达与早期HCC患者不良预后显著相关（HR=0.29）。临床队列中，RELA低表达组肿瘤体积更大（P=0.0177）。功能实验表明，RELA敲除的MT-PHHs在软琼脂中形成更多更大集落，皮下移植后肿瘤生长加速，并出现淋巴结、肺和肾上腺转移。免疫荧光显示转移灶中E-cadherin下调而N-cadherin和vimentin上调。

2.3 RELA缺失诱发原位肝癌

将携带MYC、TP53^R249S和sgRELA的PHHs移植至NSIF小鼠肝脏，400天内全部发展为肝癌，病理显示低分化癌和坏死灶。二代测序证实肿瘤组织存在TP53^R249S突变和RELA缺失，但仅17%保留MYC过表达，提示MYC非必需。

2.4 TP53^R249S突变依赖性

在HepG2-TP53^R249S细胞中，RELA敲除显著增强增殖和集落形成能力，而在野生型细胞中无此效应。MYC过表达也不改变RELA的抑癌特性，证实其功能依赖于TP53^R249S背景。

2.5 RELA缺失通过EMT促进转移

RNA-seq分析发现RELA敲除细胞中604个基因下调（富集于NF-κB和凋亡通路），526个基因上调（富集于Wnt和TGF-β通路）。3D培养显示RELA缺失导致细胞极性丧失，ZO-1定位紊乱，Transwell实验显示侵袭能力增强2.3倍。

2.6 RELA抑制Wnt/β-catenin通路

RELA缺失细胞中β-catenin核转位增加3倍，下游靶基因LEF1和CCND1表达上调。β-catenin敲除可逆转RELA缺失导致的干细胞标志物（OCT4、CD44）上调和侵袭表型。

2.7 DVL1介导的调控机制

CUT&Tag-qPCR证实RELA直接结合DVL1启动子。RELA缺失使DVL1蛋白（非DVL3）表达增加2.5倍，而DVL1敲除可减少β-catenin核定位，下调LEF1/TCF7并恢复APC表达。

2.8 RELA激动剂的治疗潜力

桦木酸（BetA）处理使HepG2-TP53^R249S细胞RELA磷酸化水平提高4倍，IC50降低至8.2μM。动物实验中，30mg/kg BetA使肿瘤体积缩小67%，转移灶减少81%，且未出现急性毒性。

3 讨论

本研究首次揭示RELA在TP53^R249S突变型肝癌中的特异性抑癌作用，其机制是通过转录抑制DVL1来阻断β-catenin核转位。临床意义在于：①RELA表达可作为早期HCC预后标志物；②BetA对TP53^R249S突变肿瘤具有选择性杀伤作用，为精准治疗提供新靶点。

4 实验方法

关键实验包括：GeCKO v2文库构建（65383个sgRNA）、NSIF人源化肝小鼠模型建立、CUT&Tag-qPCR（使用Cell Signaling Technology #8242抗体）、体内BetA给药（15-30mg/kg口服）等。统计学分析采用双尾t检验和ANOVA，显著性阈值设为P<0.05。