基于T7 RNA聚合酶体内转录CRISPR RNA的无质粒CRISPR/Cpf1基因组编辑技术开发

为解决质粒依赖型CRISPR/Cas系统在无遗传质粒生物中应用受限的问题，研究人员开发了创新型无质粒CRISPR/Cpf1编辑系统。该系统通过整合表达Cpf1核酸酶和T7 RNA聚合酶(T7RNAP)，结合短双链DNA(crDNA)和供体DNA递送，在酿酒酵母(S. cerevisiae)和星形假丝酵母(S. bombicola)中实现了高效的多重迭代基因组编辑，为遗传难操作生物提供了简便的质粒无关编辑方案。

　　

质粒载体在递送成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白(Cas)基因组编辑组件时存在明显局限——许多生物体缺乏可遗传质粒系统，且质粒构建与消除流程繁琐。这项研究创新性地开发了适用于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和星形假丝酵母(Starmerella bombicola)的无质粒CRISPR/Cpf1编辑体系。

该系统的精妙之处在于：通过基因组整合方式稳定表达Cpf1核酸酶和噬菌体T7 RNA聚合酶(T7RNAP)，配合线性DNA片段的三重奏——包含整合选择标记、由87碱基对短双链DNA(crDNA)转录的向导RNA(crRNA)、以及不超过120碱基对的同源修复模板(供体DNA)。这些组分均可通过寡核苷酸退火或重叠延伸快速制备。

实验证实，这种"即插即用"的编辑策略不仅能实现高效的多位点同步编辑，还支持连续迭代改造而无需标记回收。特别是在缺乏遗传操作质粒的S. bombicola中的成功应用，为那些传统遗传工具难以驾驭的生物体打开了一扇崭新的基因组工程大门。这项技术突破将CRISPR编辑的"施工图纸"从质粒载体解放出来，使基因组改造变得像拼装乐高积木般简单高效。