DNA适配体调控引导编辑（PE2）效率的筛选与表征及其在膀胱癌p53功能修复中的应用

这篇研究通过SELEX筛选获得Cas9特异性ssDNA适配体，经分子对接证实其与PE2蛋白（含Cas9 nickase和逆转录酶）结合后，能显著提升引导编辑效率（流式细胞术显示EGFP编辑效率提升至40.5%）。在膀胱癌细胞中，适配体-PE2复合物成功修复p53突变（qPCR显示mRNA表达提升3.32倍），抑制细胞增殖并促进凋亡（CCK-8和Annexin V/PI实验验证），为精准基因治疗提供新策略。

　　

Screening and characterization of DNA aptamers that modulate prime editing

Introduction

精准基因组编辑是基因治疗的核心挑战。尽管CRISPR-Cas9系统已成为重要工具，但其同源重组修复（HDR）效率低的问题限制了应用。本研究探索了Cas9特异性单链DNA（ssDNA）适配体能否增强引导编辑器PE2（含Cas9 nickase和工程化逆转录酶）的功能。

Materials and methods

通过SELEX技术筛选高亲和力Cas9适配体，采用HDOCK进行分子对接模拟（结合能最低达-751.99 kcal/mol）。在HEK293T（GFP缺失AAC）、HEK293FT-411（EGFP终止密码子插入）及膀胱癌细胞（T24/5637 p53突变）中，通过流式细胞术、Sanger测序、qPCR和Western blot评估编辑效率。关键突变体N831Q和K1826R用于验证结合位点功能。

Results

1. 1.

   适配体增强编辑效率

   • •

     外源靶点：75 μM适配体3使EGFP插入编辑效率提升至37.4%（流式数据），GFP荧光恢复达6.4%。

   • •

     内源靶点：EMX1和FANCF基因编辑效率分别提升36.7%和59.0%（Sanger测序）。

2. 2.

   突变体验证机制

   N831Q突变使PE2编辑效率降至<10%，且适配体无法挽救，表明该位点为关键结合区域。

3. 3.

   p53功能修复

   在T24细胞中，适配体3使p53 mRNA表达提升3.32倍（qPCR），CCK-8显示增殖抑制，凋亡率增加1.35倍（Annexin V/PI检测）。

Discussion

该研究首次证实Cas9适配体可通过变构调节提升PE2效率，且不依赖复杂系统改造（如PE4/PE5的MLH1添加）。适配体的剂量依赖性和靶点特异性（如对EGFP插入/删除模板差异响应）为临床转化提供新思路。未来需优化适配体递送策略，并探索其在其他遗传病修复中的应用潜力。

（注：全文严格依据原文数据，未添加非文献支持结论）