CRISPRi与Tn-seq联合解析艰难梭菌必需基因谱：抗生素靶点发现与细胞分裂机制新见解

这篇研究通过CRISPR干扰（CRISPRi）和转座子插入测序（Tn-seq）技术，系统鉴定了艰难梭菌（Clostridioides difficile）R20291菌株的346个必需基因，其中283个与既往研究重叠形成"核心必需基因组"。研究验证了>90%靶基因的必需性，发现80%基因敲低导致形态异常，并首次鉴定18个定位于分裂位点的新蛋白（如YlmG/YlxW/YlxX），为开发窄谱抗生素和解析该病原体独特分裂机制提供了关键靶点与工具。

　　

摘要

研究采用CRISPR干扰（CRISPRi）和饱和转座子突变（Tn-seq）技术，在流行株R20291中鉴定出346个营养生长必需基因，其中283个与前期研究重叠。CRISPRi靶向181个基因时，92%表现出生长缺陷，80%伴随形态异常。通过红色荧光蛋白（RFP）标记发现18个潜在新分裂蛋白，其中3个在厚壁菌门中保守但功能未知。

引言

艰难梭菌感染（CDI）每年在美国导致近1.3万人死亡，现有抗生素会破坏肠道菌群平衡。必需基因既是细菌生理核心，也是抗生素开发靶点。Tn-seq通过转座子插入缺失鉴定必需基因，但可能因极性效应或生长迟缓产生假阳性；CRISPRi通过dCas9-sgRNA沉默基因表达，能同时观察表型变化。

结果与讨论

CRISPRi敲除文库构建

针对404个前期鉴定的必需基因，剔除转座酶/噬菌体相关基因后选择181个靶点，每个基因设计2个sgRNA（共362个质粒）。91%的sgRNA在630菌株中同样有效，20个非靶向sgRNA作为阴性对照。

必需性验证与表型分析

在含1%木糖的TY-Thi10平板上，167个基因（92%）显示强/中度生长缺陷。显微镜观察发现：

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  DNA复制基因（如dnaX）敲除导致丝状体和DNA凝聚

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  细胞分裂基因（ftsZ/zapA）敲除产生无隔膜丝状体

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  肽聚糖合成基因（pbp2/rodA）敲除导致短粗链状细胞

  意外的是，RNA聚合酶β亚基（rpoB）敲除也引起丝状化，而鸟苷酸合成酶（guaA）敲除导致链状排列。

Tn-seq新数据分析

三组独立文库共覆盖基因组57.6%的TA位点（502,945个中289,505个），经TRANSIT2分析发现：

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  初代文库鉴定263个必需基因，延长培养后新增72个

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  与Dembek等研究相比，本研究鉴定基因数更少（346 vs 404），但83%重叠

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  典型差异案例：DNA聚合酶polA在本研究中显示N端结构域必需（3'端允许插入），而ATP合酶操纵子（atpIBEFHAGDC）被错误归类为非必需

细胞分裂机制新发现

通过RFP标记筛选发现：

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  七种肽聚糖合成酶（包括PBP1/PBP2/RodA）定位于分裂位点

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  MreC/MreD（传统认为参与伸长）也显示分裂位点富集

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  三个保守未知蛋白（YlmG/YlxW/YlxX）首次被证实定位分裂位点

代谢网络特征

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  缺乏典型电子传递链，但F₀F₁-ATP酶必需性被CRISPRi证实（木糖预培养后生长停滞）

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  甲羟戊酸途径（MEP）基因（dxr/ispDEFGH）必需，为脂质II合成提供萜类前体

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  双组分调控系统WalRK和DdlR被证实调控细胞壁合成

潜在抗生素靶点

15个功能未知的必需基因中，9个敲除导致形态异常，如：

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  CDR20291_0828（DUF1846结构域）敲除引起细胞伸长

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  CDR20291_1053-1056簇（糖基转移酶家族）敲除导致短粗链状细胞

材料与方法

实验采用R20291菌株，在厌氧条件下培养。CRISPRi使用P_xyl诱导dCas9和P_gdh驱动sgRNA。Tn-seq文库通过mariner转座子构建，经线性PCR和C加尾处理后进行Illumina测序。蛋白定位采用4%多聚甲醛固定，MicrobeJ分析荧光分布。

结论

研究建立了艰难梭菌最全面的必需基因数据集，揭示其与枯草芽孢杆菌的核心差异（如smpB必需性），开发的功能基因组工具可用于靶向药物筛选。新发现的分裂位点蛋白为理解厚壁菌门分裂机制进化提供了线索。