金黄色葡萄球菌中可编程无选择压力CRISPRi系统的开发及其在宿主长期互作研究中的应用

本研究针对传统CRISPR干扰(CRISPRi)系统在细菌基因功能研究中依赖抗生素选择和诱导剂的局限性，开发了一种基于pCM29质粒的可编程无选择压力CRISPRi(ppsf-CRISPRi)系统。该系统利用金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)内源启动子调控dCas9表达，通过靶向沉默凝固酶(coa)和自溶素(atl)基因，在无需外源诱导和抗生素压力下实现≥27代的稳定基因沉默。研究证实该系统在体外血浆凝固实验、THP-1巨噬细胞感染和蜡螟(Galleria mellonella)感染模型中均能有效模拟基因敲除表型，为长期宿主-病原体互作研究提供了新工具。

　　

在抗生素耐药性危机日益严峻的背景下，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)等"超级细菌"的致病机制研究显得尤为重要。传统基因功能研究手段如基因敲除技术存在操作繁琐、仅适用于非必需基因等局限，而常规CRISPR干扰(CRISPRi)系统虽能实现基因沉默，却依赖抗生素维持质粒稳定性和外源诱导剂调控表达，这些因素会干扰宿主-病原体互作研究的真实性。特别是在长期感染实验中，抗生素的代谢衰减和诱导剂的药代动力学问题常导致实验数据失真。

针对这些技术瓶颈，Roni Miah团队在《iScience》发表了创新性研究，开发出可编程无选择压力CRISPRi(ppsf-CRISPRi)系统。该系统基于pCM29质粒平台，通过S. aureus内源启动子(如凝固酶coa和自溶素atl基因的启动子)调控dCas9表达，结合组成型P3启动子驱动的sgRNA表达，实现了无需抗生素选择和外部诱导剂的长期基因沉默。研究人员采用低温克隆策略克服了dCas9在大肠杆菌中的表达毒性问题，通过qPCR、血浆凝固实验、THP-1巨噬细胞感染和蜡螟幼虫模型等多维度验证系统效能。

关键技术包括：1) 使用pCM29质粒构建系统，验证其在无氯霉素选择压力下稳定存在≥27代；2) 采用内源启动子调控dCas9与报告基因gfp的串联表达；3) 针对coa和atl基因设计特异性sgRNA；4) 建立三阶段连续传代培养体系评估系统稳定性；5) 应用人源THP-1巨噬细胞和蜡螟感染模型进行功能验证。

质粒稳定性验证

通过监测GFP荧光强度和qPCR定量质粒拷贝数，证实pCM29在无氯霉素条件下能稳定维持27代以上。在TSB和RPMI+培养基中，携带ppsf-CRISPRi的菌株MR36荧光信号稳定，质粒拷贝数保持恒定，为后续无抗生素实验奠定基础。

凝固酶基因沉默

靶向coa基因的MR36菌株在连续传代后仍能显著抑制coa mRNA表达(降低约90%)，且不受培养基类型和氯霉素存在与否影响。功能实验显示，沉默菌株完全丧失血浆凝固能力，而对照菌株保持正常凝固活性，证明系统能有效阻断毒力因子功能。

巨噬细胞感染研究

靶向atl基因的MR37菌株在THP-1感染模型中表现出与atl转座子突变体相似的表型：巨噬细胞存活率显著提高，细菌内化减少约10倍。该效应在有无氯霉素条件下均稳定存在，证实自溶素缺陷会削弱细菌侵入宿主细胞的能力。

蜡螟感染验证

在昆虫感染模型中，atl靶向的MR40菌株毒性显著减弱，幼虫存活率较对照组提高30%，表型与atl突变体完全一致，证明系统在体内环境中仍保持功能。

这项研究的意义在于：1) 首次在S. aureus中实现完全摆脱抗生素和诱导剂依赖的CRISPRi系统；2) 内源启动子的应用使基因沉默与生理调控同步，更真实反映基因功能；3) 荧光报告模块实现基因表达与沉默的双重监测；4) 为研究细菌亚群特异性基因调控提供新思路。尽管当前系统暂不适用于必需基因研究，但通过选用弱组成型启动子或条件激活型启动子，未来可望拓展应用范围。该技术方案也为其他病原菌的基因功能研究提供了可借鉴的蓝本，对揭示病原-宿主互作机制和发现新药靶点具有重要价值。